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性传播疾病病原体检测基因芯片研究

石岗  
【摘要】:本课题将基因芯片技术用于性传播疾病病原体诊断与检测研究,制备了以荧 光标记多重不对称PCR技术为基础的性传播疾病病原体寡核苷酸检测芯片,实现 了淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体三种病原体的同时多样本检测。 通过芯片制备工艺条件研究确定制备性传播疾病病原体检测芯片的最佳方案 是采用长度40mer,3’端双功能修饰的寡核苷酸探针点制到醛基片上制备芯片。在 此基础上,设计并合成了三种病原体以及荧光素酶基因和大豆基因特异的引物和 探针序列。以此引物和探针对性病检测芯片优化结果显示:选取点样液A和杂交 液B,探针序列靠近荧光标记引物端,探针浓度以50μM,杂交温度以42℃,杂交 时间以60min,PCR产物经加热变性后与杂交液以1:2比例制备检测芯片为宜。对 该芯片的检测灵敏度进行条件优化表明:在25μl PCR反应体系中,淋球菌、沙眼 衣原体和解脲脲原体和荧光素酶基因正向引物浓度分别为0. 225μM、0. 135μM、 0. 15μM和0. 3μM,反向Cy3标记的荧光标记引物浓度分别为2. 25μM、1. 35μM、 1. 5μM和3μM,dNTP为300μM,MgCl2 3mM,KCl 75mM,1×PCR缓冲液和2U Taq 酶。PCR扩增条件为:预变性(5 min/94℃);35个循环:变性(30 sec/94℃),退火(30 sec/57℃),延伸(30 sec/72℃);延伸:(5 min/72℃)。以此条件进行多重PCR扩增, 芯片检测的灵敏度最高,四个基因皆为5×103copies。 特异性实验表明芯片对待检病原体特异。对60份临床标本进行淋球菌、沙眼 衣原体和解脲脲原体检测,芯片检测方法与临床PCR诊断方法的符合率分别为 97. 2%、100%和75. 2%。


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