利用毒理基因组和代谢组学技术研究Z24的毒理机制

【摘要】：现代药物学研究不但在应用新技术如计算机辅助设计、药物组合化学和活性 筛选技术上发生了巨大的进步，而且在药物研究思路上也发生了重大的转变。过 去、只在药物研发后期的临床前和临床阶段才进行药物毒理学评价和研究；现 在，为了尽早发现和淘汰因毒性问题而不适于继续研发的化合物，指导合成更安 全的同类化合物，大多数制药公司在新药发现阶段即对新化合物实体(NCEs)进 行毒理学与药理学、药效学、药代学相结合的筛选和优化。通过综合分析药效 学、药代学及毒理学的各项指标，评价系列NCEs的研发前景，从中选出候选新药 进行后续研究或作进一步的结构优化改造，形成了发现毒理学这一学科。 发现毒理学的研究思路是将药物毒性优化筛选和评价贯穿于新药发现、临床 前安全性评价和临床安全性评价的整个过程中，以达到加快药物研发进程、降低 药物研发费用、提高研发成功率的目的。发现毒理学的主要技术之一为现代组学 (‘-omics’)技术(如基因组学和代谢组学技术)，用于研究先导化合物的毒作用机 制，确定与毒作用相关的生物标志物，从全局观点分析生物体在生理、病理及毒 理状态下发生的各种动态变化过程。基因组学技术是在基因水平上根据机体基因 表达的变化研究和预测药物潜在的毒性作用。代谢组学技术则是利用核磁共振仪 等仪器测定生物体液和组织提取液中的内源性代谢产物，通过分析生物体液或组 织中代谢产物谱的变化，研究机体整体生物学状况和功能调节。通过代谢组研究 可以进行药物毒性筛选，毒性靶器官和毒性发生、发展和恢复过程中生物标志物 的研究。 Z24系列化合物由本所李松研究员等正在研发的1类新型抗癌药，其主要作 用靶点为血管内皮生长因子(VEGF)和Bcl-2。本研究课题采用毒理基因组和代 军事医学科学院博卜论文 谢组学技术、生物信息学的手段，对224的毒性作用机制做了初步的研究，探讨 了基因组和代谢组学技术在药物毒性研究中的应用，取得了如下结果。 第一章利用毒理基因组技术研究224肝毒性的作用机制 第1节224系列化合物的一般毒性筛选研究 采用MTT比色法和上下法对224系列化合物进行毒性筛选，结合此系列化合 物药理、药代活性的比较，最终选定毒性小，药理、药代活性较好的224作为候 选药物进行毒理作用机制研究。 第2节224肝脏毒性的评价 小鼠经口给予。、40、80、120m叭9 22430天后，采集血浆进行血液生化测 定，处死小鼠采集脏器进行病理检查实验。结果12om叭g剂量组血浆生化指标 AST、ALT、Thn分别升高了97%、281%、178%;病理检查发现80和120m留kg 剂量组224对小鼠肝脏造成不同程度的损伤。 第3节利用基因芯片分析224肝毒性的作用机制 HePGZ细胞体外染毒0.248(ICZ。)和0.78 mM(ICS。)224 24h后，收集细胞并 提取mRNA，cy3和cys荧光标一记后与基因芯片杂交，根据信号的变化确定发生 改变的基因:结果表明在0.248mM浓度情况下有15个基因发生显著(两倍以 上)的变化，0.78 mM 224浓度下发生改变的基因数增加到244个，其中有6个 基因在两种浓度情况下都发生较为一致的改变。对发生改变的基因聚类分析结果 发现，差异表达基因主要为与肝脏再生，细胞周期和分化，细胞凋亡，肿瘤和能 量、脂肪和氨基酸代谢及某些疾病有关的基因。利用BLAST软件对差异表达基 因的mRNA和蛋白质序列和KEGG和CSNDB数据库中的基因进行序列比对分析 发现，224的毒性作用与死亡受体(DR)介导的信号途径和细胞能量代谢途径 (如糖酵解)有关。据此预测224的肝脏毒性作用机制可能为诱导DR所介导的细 胞凋亡和机体能量代谢障碍。 第4节基因芯片实验结果的验证 光、电镜细胞形态分析表明0.248mM和0.786mM 224体外染毒24h后， HePGZ细胞呈现明显的凋亡形态;蛋白质westem印迹检测发现224处理后 HepGZ细胞easpase3、DR4、CytC和哪一Kb的表达增高，Bel一xl表达降低。此 外，在一定浓度下224处理HePGZ细胞24h能诱导细胞断片化水平升高;同时， casPase工抑制剂和caspase3抑制剂可阻断224所引起的DNA断片化。由此可 见:224能够引起HePGZ细胞凋亡，凋亡的发生与casPase酶的激活有关。另一 方面，活体免疫组织化学检测发现小鼠经口给予224 30天后，肝脏DR4、 Caspase3和T毛〕NEL表达水平呈现明显的剂量依赖性增加。上述体内外实验结果 军事医学科学院博卜论文 表明:224的肝脏毒性与DR信号途径所介导的细胞凋亡有关，与基因芯片实验 的预测一致。 第二章利用代谢组学技术研究224的毒理机制 第1节典型肝毒物与224肝脏毒性的代谢组学研究 20只Wistar大鼠随机分为4组，每组5只，收集24h尿液后分别单次给予 Zoomg/kg 224(灌胃)、500mg/kg对乙酞氨基酚(””)(腹腔注射)、 6Omg/kg氯丙嗦(CpZ)(灌胃)和饮用水(灌胃)。给药后24h、48h、96h等分 别收集尿液，测定尿液’H NMR谱进行代谢组学研究。同时测定以下血浆生化指 标:ALT、AST、ALP、Crea、BUN、CK、ALB、GLU和TBil。结果表明单次 给药224、AP”和CPZ的代谢组轨迹都能够明显地与对照组代谢组的轨迹