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人蛋白C的研制及其相关研究

沈永才  
【摘要】:人蛋白C(human Protein C,hPC)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原, 属血浆糖蛋白,相对分子量是62KDa。蛋白C系统是一种重要的抗凝机制之一, 该系统由蛋白C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白S(PS)、蛋白C抑制物及新近 发现的内皮细胞蛋白C受体(EPCR)组成。活化蛋白C的主要功能是抗凝、抗炎和 促纤溶。近年来,活化蛋白C在感染性疾病,特别是在严重脓毒症、内毒素血症 和弥散性血管内凝血等严重感染性疾病中的治疗备受关注。 随着人血浆PC及重组人蛋白C(recombinant human Protein C,rhPC)在疾病 治疗应用范围的扩展,建立简便、快速、灵敏和特异的人PC检测方法显得尤为 重要。目前,国外的蛋白C制品(血浆浓缩剂及重组制剂)和诊断试剂价格较昂 贵,不适合临床的推广应用。国内蛋白C的研究处于起步阶段,因此对蛋白C制 品及诊断试剂的研究将有广阔的市场前景。 本研究包括: 1 物理化学方法纯化人血浆蛋白C:将3000ml新鲜冷冻血浆为起始材料,以 DEAE-Sephadex A 50为吸附介质,收集洗脱产物,再经DEAE-Sepharose FF及肝 素-Sepharose CL 6B层析,对收集产物进行APTT、SDS-PAGE及Western blotting 检测,获得纯度大于95%的人血浆蛋白C。 2 人蛋白C cDN_A在CHO-dhfr细胞中的表达:利用脂质体转染技术将含有人 蛋白C cDNA基因和二氢叶酸还原酶基因的载体转入CHO细胞中,经过MTX 中文摘要博士学位论文 (6.4umol/L)抗性筛选,APTT、SDS一PAGE及westem blotting检测获得了6株 高表达的细胞株。 3人蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定:利用人血浆蛋白C纯化产物免疫 BALB/C小鼠制备了5株人蛋白C单克隆抗体细胞株,分别进行了效价、亚类、 特异性及亲和力等鉴定。 4人蛋白C单克隆抗体的初步应用 l)酶联免疫分析法检测人血浆蛋白C:利用两株识别不同人蛋白C位点的单 克隆抗体细胞株建立了夹心ELISA检测人血浆蛋白C。此方法可用于检测血浆中 3.12~ZO0ng/mL范围内蛋白C,实验可在4小时内完成,实验的批内和批间变异 不超过7%,测得102份正常血浆样品的参考范围是4.02士0.295林留mL 2)亲合层析法纯化人血浆蛋白C:先用DEAE一S叩hadexA一50吸附人血浆, 然后将吸附产物过人蛋白C单克隆抗体与澳化氢活化的SePharose 4B偶联制备亲 和层析柱,获得人蛋白C的纯化产物。此方法可使纯化产物浓缩16700倍,纯度 超过99%。 本研究建立了人血浆蛋白C的纯化(物理化学纯化与亲和层析)方法,有望用 于规模化生产;在国内首次实现人蛋白C CDNA在dhfr缺陷型CHO细胞中的高效 表达,为今后蛋白C的进一步研究打下了基础;建立了抗人蛋白C单克隆抗体杂 交瘤细胞系,利用两株识别不同抗原位点的单克隆抗体建立了夹心EL工SA检测人 血浆蛋白C的方法,为临床检测人血浆蛋白C奠定了基础。


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