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线性中和表位在抗毒素免疫保护中的作用研究

赵小玲  
【摘要】:一种抗毒素能否有效地中和生物毒素,取决于它结合生物毒素中和表位的能 力,因此,中和表位是免疫保护作用的核心靶点。线性中和表位由于其氨基酸序 列在一级结构上是连续的,较容易在体外模拟其天然表位。因此,本研究采用线 性中和表位作为靶标,应用噬菌体抗体库技术,进行了人源抗毒素制备的研究, 旨在获得特异、高亲和力的人源抗毒素,探讨以线性中和表位作为免疫、筛选抗 原制备抗毒素的可行性,从而为其它中和抗毒素的制备提供理论和技术依据。 本研究依据狂犬病毒糖蛋白Gp线性中和表位G5的氨基酸序列合成表位多肽 G5-24,用狂犬病毒Vero疫苗和G5-24表位多肽对三名志愿者进行了免疫,从免 疫者外周血淋巴细胞中分离、构建了单链抗体(scFv)基因,应用噬菌体抗体库技 术构建抗狂犬病毒人源噬菌体单链抗体库;并用G5-24表位多肽筛选特异噬菌体 抗体,分析确定针对靶标G5-24表位多肽的人源scFv基因。结果构建了库容为 8×107的人源单链抗体库;获得了与G5-24表位多肽有高亲和性,并具有完整抗体 可变区的噬菌体抗体,该抗体的重链属于人重链IgG VHⅣ家族,轻链属于VK Ⅰ 家族,通过网络对其CDR进行分析,结果证明它是一株新发现的抗狂犬病毒的单 链抗体基因。 对筛选获得的人源抗G5-24 scFv(VL-VH)基因进行了重构,将它们克隆入 表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3) ,IPTG诱导表达;对重组表达 蛋白用Ni-NTA柱纯化后,采用尿素梯度透析法进行复性。对scFv(VH-VL)和scFv fvL-VH)的亲和力和热稳定性进行了初步检测。结果表明,成功构建了scFv (VH-VL)基因;实现了scFv(VH-VL)和scFv(VL-VH)在原核中的高效表达,二者 的表达量均占菌体总量的35%以上,且成功的纯化了表达的重组蛋白,复性后获 得了有活性的纯化重组蛋白。硫氰酸盐洗脱法检测结果表明scFv(VH-VL)的相对亲 和力指数为0. 8mol/L,scFv(VL-VH)的亲和力指数稍高,为0. 95mol/L。但是,二 者的热稳定性均不理想。 军事医学科学院博士学位论文 中文摘要 为了提高抗GS一24 ScFv的稳定性,应用PCR定点突变的方法分别在VH第44 位和VL第100位引入Cys,构建抗GS一24 dsFvVH、VL基因,并将二者在原核 表达系统PET-22b(+)/BLZI(D E3)电分别表达。VH和VL包涵体分别在GuHCI 变性缓冲液中溶解,混合加入折叠缓冲液中,使VH和VL正确折叠形成有活性的 dsFv抗体片段,上Ni一Nl’A柱纯化。结果表明,本研究成功构建了抗GS一24 dsFv 基因,制备了纯化的人源抗GS一24抗毒素。 dsFv的生物学特性测定,以其亲本scFv作为对照,对其免疫学、稳定性和保 护作用进行了评价。结果显示,与其母本抗体scFv相比,改构后的抗GS一24 dsFv 保持了对GS一24表位多肤和Vero疫苗的特异性识别能力,而且其亲和力明显提高; 抗GS一24 dsFv与ScFv相比,其在血清和PBS中的稳定性有明显的改进,而且dsFv 的热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进,抗GS一24 dsFv可特异性的中 和狂犬病毒,阻止病毒对Vero细胞的吸附,从而可抑制狂犬病毒对靶细胞的感染。 上述结果表明,本研究采用线性中和表位GS一24多肤作为免疫和筛选靶标, 得到了特异性、高亲和力的人源噬菌体ScFv,并成功地对抗GS一24 ScFv进行了稳 定性改构,制备了功能性人源抗GS一24 dsFv。表明以线性中和表位作为靶标,制 备人源抗毒素的技术路线是可行的。 本研究的创新点在于建立了一种以线性中和表位作为靶标,构建噬菌体抗体 库、筛选制备人源抗毒素的技术路线;所获得的抗GS一24抗毒素是一株新型抗狂 犬病毒人源抗毒素。


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