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大脑皮层神经元体外诱导分裂研究

林秋霞  
【摘要】:传统的观点认为,神经元是终末分化的细胞,不再具有分裂增殖的能力。但 是,我们实验室在以往的研究工作中,运用免疫双标记、连续摄影和膜片钳方法, 发现成年大鼠来源的神经干细胞诱导分化的神经元与新生大鼠来源的皮层神经元 在一定条件下可以分裂。分裂神经元表达分化神经元的特异性蛋白和神经递质, 并且具有分化神经元的典型电生理特征。前期工作初步提供了分化神经元可以分 裂的证据,本研究用现代生物医学技术对神经元分裂问题进行了进一步的探讨。 在第一部分的实验中,我们首先进行了皮层神经元的混合培养,同时运用免 疫细胞化学的方法,对混合培养的神经元进行了PCNA与nestin的检测。结果显 示培养物中有PCNA阳性细胞,但是并没有nestin阳性细胞,表明培养物中没有 神经干细胞与前体细胞,仅仅存在有胶质细胞与成纤维细胞,可以用于神经元分 裂的研究。为了进一步的研究神经元分裂的分子机理,必须获得高纯度的神经元, 高纯度神经元的培养极其困难。我们对文献报道的原代神经元纯化和培养方案进 行了优化,并且以MAP2作为标志物,用细胞计数和流式细胞分析的方法对神经 元的纯度进行了检测。计算MAP2阳性神经元在PI标记总细胞中的绝对数比例, 培养纯化后的分化神经元可达99%以上。流式细胞分析结果显示MAP2阳性神经 元可达总细胞数的99. 8%。上述结果证明,混合培养与纯化培养的神经元都可以 用于神经元诱导分裂的研究。 在第二部分的实验中,我们以混合培养的神经元作为研究对象,对神经元诱 导分裂的现象进行了探讨。首先,在相差显微镜下,我们在EGF与bFGF诱导分 裂的培养物中观察到了相当数量的处于有丝分裂不同时期的神经元样细胞,这些 神经元样细胞具有典型的神经元的外形特征。然后,我们对诱导分裂的培养细胞 进行了MAP2/NSE免疫荧光染色与PI化学染色,分别在荧光和激光共聚焦微镜下 观察记录。我们捕捉到了一些MAP2/NSE免疫反应阳性、处于有丝分裂不同时期 的神经元,这些分裂细胞也具有典型的分化神经元的外形特征。ShcC被认为是一 种只存在于分化成熟神经元、而不存在于神经干细胞和前体细胞的一种蛋白。为 了进一步证明我们诱导分裂的细胞是分化神经元,而不是神经干细胞和神经前体 细胞,我们再次将ShcC作为分化神经元的特异性标志物,研究诱导分裂的细胞是 军事医学科学院博士学位论文一2- 否为分化成熟的神经元。结果显示,在诱导分裂剂的作用下,培养物中同样可以 观察到SheC免疫反应阳性、处于有丝分裂不同时期的神经元。在胶体金标记蛋白 A免疫电镜研究中,我们也观察到了一些处于有丝分裂不同时期的神经元,这些 分裂细胞不仅具有分化神经元所特有的典型的超微结构,而且在细胞浆中散在有 大量的NSE一胶体金颗粒。我们还观察到,有丝分裂后期神经元的细胞体与其它神 经元的突起形成了为数不少的典型的突触结构。免疫荧光标记与免疫电镜的研究 结果进一步证实了神经元分裂,不但显示分裂细胞具有分化神经元的特异性蛋白 和典型超微结构特征,而且证明处于分裂时期的神经元具有成熟神经元特有的化 学信号传递功能。 在第三部分的实验中,我们对神经元诱导分裂可能的机理进行了初步探讨。 首先以纯化培养的神经元作为研究对象,运用W七stem blot技术检测诱导分裂后不 同时间(4h、sh与 ZOh)神经元内的多种细胞周期相关蛋白与p一MApK的表达 变化情况。结果显示,在诱导分裂后的神经元内,三种细胞周期相关蛋白(包括 cyclin Dl、cyclinE和cdkZ)的表达水平升高,但是各种蛋白的表达水平达到高峰 的时间不同。其中,调节Gl期RP(restrict poini)的cyclin Dl在诱导分裂后4h 首先达到高峰;然后调节Gl期向S期过渡的cyclinE达到高峰;最后,与S期和 G2期相关的cdkZ达到高峰。同时,p一 MApK在诱导分裂后出现了表达,并且水 平呈逐渐上升的趋势,提示神经元分裂可能与MAPK信号转导通路相关联。Necdin 是维持神经元分裂后静止状态的一个非常重要的生长抑制因子,能够与EZFI的转 录激活域相互作用,抑制EZF推动的转录过程。通过原位杂交与半定量RT一PCR 的方法,我们分别检测比较了对照组神经元和诱导分裂剂作用24h与48h的神经 元内needin mRNA表达水平,发现与对照组神经元相比,24h组神经元内necdin mRNA的含量明显降低,而在48h组神经元又戏剧性地恢复到正常水平,初步说 明Necdin参与了神经元分裂的过程。最后,我们以不加诱导分裂剂的混合培养神 经元为研究对象,用RNA干扰技术探讨沉默necdin mRNA对神经元的影响。在携 带GFP标签的PsiRNA hHIGFPzeo Gz一PISRNA一needin重组质粒转染后不同时间固 定培养细胞,用神经元特异性标志物N助于2进行免疫荧光标记,以Hoechst标记 细胞核物质。然后在荧光与激光共聚焦显微镜下观察needin mRNA沉默的神经元, 探讨needin mRNA的沉默是否可以引起神经元的分裂。我们观察到了处于有丝分 军事医学科学院博士学位论文一3- 裂不同时相、具有GFP标记的MAPZ阳性神经元,而无GFP标记的神经元中未观 察到分裂现象。 以上研究基本证明了分化成熟神经元在一定条件下可以


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