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骨关节炎相关Smad3突变基因的克隆及其初步的功能分析

万海峰  
【摘要】:转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一类分泌型多肽信号分子,有调节细胞的增殖、分化、粘附、移行及凋亡的作用。Smads基因是TGF-β信号转导途径中一个重要的基因家族,它们可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导入细胞核内。近年来,通过对Smads基因剔除小鼠的研究,发现不同Smads在胚胎发育、骨骼形成、免疫功能维持、心血管系统发育、癌症的发生等生理和病理过程中均起着重要的作用。本论文从两个不同的方面进行实验安排,为进一步研究Smads的功能打下了坚实的基础。 Smad3基因是Smads家族中重要的受体激活型的成员,运用基因剔除的方法研究Smad3功能表明,Smad3参与免疫调节、创伤愈合、软骨与骨骼的发育与维持等重要的生理与病理过程。以往的研究结果显示Smad3错义突变(P197N→I)可能与骨关节炎发生的病理过程有关。为此我们构建了带有该点突变的Smad3cDNA的表达载体,转染Smad3基因缺失的成纤维细胞,检测细胞培养液中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表达水平和活性变化。结果显示,转染野生型Smad3表达载体可以使Smad3基因缺失的成纤维细胞MMP-2表达活性明显降低,而转染Smad3突变体表达载体丧失对MMP-2表达活性的调节作用。提示骨关节炎相关的Smad3突变体可能丧失对成纤维细胞表达MMP-2的抑制作用,在骨关节炎的发生过程中可以具有一定的作用。 过去研究选择成骨细胞特异表达的骨钙素基因2(OG2)启动子,指导Cre重组酶基因的表达,构建了转基因载体pOG2-Cre-hGH,显微注射获得转基因小鼠,外源基因多拷贝随机整合,导致基因表达水平不确定。本实验将小鼠首建者与Smad4条件基因打靶小鼠杂交(Smad4第八外显子被两个同方向的LoxP序列锚定,Smad4~(co/co)),以检测Cre重组酶介导的重组及其组织特异性。通过Southern-Blot杂交检测子代鼠,发现基因型为Cre-Smad4~(co/co)的子代鼠的头盖骨和腿骨基因组中Smad4第八外显子被剔除,初步证实Cre重组酶在骨组织中特异表达,介导LoxP序列间的重组。Cre-Smad4~(co/co)小鼠相对于野生型小鼠体重和体长存在显著差异,无繁育能力,为研究Smad4在骨组织的功能提供了良好的小鼠动物模型;而且成骨细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠的研制成功,为今后利用Cre/LoxP系统,研究其它基因在成骨细胞中的作用提供了先决条件。


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