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重组BoNT/ALC、BoNT/BHc2、BoNT/EHc2片段的表达纯化及BoNT/EHc2的免疫保护作用

贾宏丽  
【摘要】:肉毒毒素(BoNT)有A~G7个血清型,其中,BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E三型毒素主要引起人类的肉毒中毒。BoNT在结构上分为两部分:轻链(LC,50 kD)为活性结构域,具有锌依赖性金属内肽酶活性;重链(HC,100 kD)为结合和转位结构域。其中,HC的C末端(H_C,50 kD)负责与靶细胞膜上相应受体结合,又可分为两部分:H_C1和H_C2。目前BoNT是重要的毒素战剂和高度危险的生物恐怖剂之一,因此,开展重组BoNT抗原片段的研究,对研制诊断抗体和预防疫苗具有重要意义。 为了表达重组BoNT/A LC、BoNT/BH_C2、BoNT/EH_C2,培养肉毒梭菌A、B、E将其无毒化处理作为模板,以PCR方法分别扩增出BoNT/A LC、BoNT/BH_C2、BoNT/EH_C2片段,将目的片段连接至pGEM-T载体进行测序鉴定。序列分析结果表明,3个基因片段与所报道的相应基因序列的一致性均在99%以上。然后以BamH Ⅰ+Xho Ⅰ或BamH Ⅰ+Nhe Ⅰ对pGEM-T-LC、pGEM-T-BH_C2、pGEM-T-EH_C2与原核表达载体pET21a或pET28a进行双酶切并连接,获得分别含3个基因片段的重组质粒pET21a-LC、pET28a-BH_C2和pET28a-EH_C2。经过鉴定后转化E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞,用IPTG进行诱导表达后,发现BoNT/A LC、BoNT/BH_C2和BoNT/EH_C2重组蛋白都以包涵体形式存在,表达量分别达到全菌蛋白的23%、18%和37%。利用重组蛋白带有6×His标签的特性,用螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲合层析柱对重组蛋白进行一步纯化,rBoNT/A LC和rBoNT/EH_C2的纯度在95%以上;但rBoNT/BH_C2在经过Ni-NTA柱纯化过程中发生降解,产生小片段。经Western印迹和间接ELISA分析,3种重组蛋白均可被相应的抗天然BoNT马血清或兔血清所识别,显示其具有良好的抗原性。 在所获得的3种重组蛋白中,选择rBoNT/EH_C2进行了小鼠的免疫保护评价。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,待效价升高到一定程度后用激活的E型肉毒梭菌培养上清进行攻毒。结果显示,免疫后的小鼠可以抵抗2 MLD的BoNT/E攻击;用5 MLD的BoNT/E注射小鼠,有50%的小鼠存活;注射10 MLD和20 MLD的BoNT/E,小鼠无一存活。经统计学分析,各组小鼠的存活率差异具有显著性意义。抗rBoNT/EH_C2鼠血清的中和实验也表现了相似的结果。


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