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重组人乙酰肝素酶的克隆表达及其生物学特性的初步研究

凌焱  
【摘要】:乙酰肝素酶(Heparanase,HPA)是能特异性降解细胞外基质和基底膜中的硫酸肝素糖蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)的内切糖苷酶。由于HSPG具有抑制肿瘤转移的重要作用,HPA是多种肿瘤具有转移活性的标志之一,已经成为了研究肿瘤转移的重要靶点。但由于HPA获取困难,其分子结构、生物学功能、活性调节等多方面尚待进一步阐明。 近年来的研究发现全长HPA cDNA编码了HPA酶原前体,在合成与分泌的过程中去除了信号肽,形成低活性的HPA酶原,再经过特异性的调控激活后被未知的水解酶切割为大小不同的2个亚基,二者再通过非共价结合形成异源二聚体,此异源二聚体可能就是HPA的活性形式。 为探究HPA结构与功能的关系以及其在肿瘤转移中的作用,需要获得HPA重组蛋白以及其抗体。因此本文利用基因重组技术,构建表达巴斯得毕赤酵母和大肠杆菌重组工程菌,实现了在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达HPA酶原及其大亚基,并分析了影响HPA基因在不同表达系统中表达的情况。将表达产物经过复性并分离纯化后,利用HPA酶原及其大亚基制备了多克隆抗体。在此研究基础上,利用细胞免疫组化手段,检测了在多种具有肿瘤转移活性的细胞中HPA表达情况,结果表明,HPA的表达与肿瘤转移活性相关。通过在体外细胞实验实现将低活性的HPA酶原转变为高活性的形式。通过蛋白质体外结合实验证明了分别表达的HPA大小亚基蛋白分子之间能够相互识别。初步分析了HPA结构与其功能的关系,为进一步揭示HPA的作用机制打下一定的基础。


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