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前列腺癌细胞结合单链抗体的筛选、表达纯 化及其功能初步研究

田媛  
【摘要】:本研究旨在筛选出与人前列腺癌细胞结合特异性较高的抗体,以期有助于前列腺癌的早期诊断与低损伤性治疗。 首先用人前列腺癌细胞PC3、C4-2、DU145的膜蛋白混合物免疫BALB/c小鼠,从免疫鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR构建出组合单链抗体cDNA文库,通过噬菌体表面呈现,用人前列腺癌细胞PC3对噬菌体-单链抗体库(phage-scFv)进行亲和富集及phage-ELISA筛选鉴定,获得一种与人前列腺癌细胞系PC3结合特异性较高的单链抗体scFv P-9,其与PC3最小结合滴度与对照细胞LNCaP最小结合滴度相比低150多倍,说明其与PC3细胞具有较强的结合特性。经序列测定及与鼠抗体可变区序列库进行同源性比较,确定其V_H属于鼠抗体重链可变区基因家族Ⅲ(C)亚组;其V_L属于鼠抗体κ轻链可变区基因家族Ⅳ组。且未发现任何已知单链抗体与之序列相同。 将scFv P-9插入pTIG-Trx载体,单链抗体在大肠杆菌BL21(DE3)中得到可溶性表达,ELISA检测表明诱导后在BL21(DE3)胞浆中的单链抗体可与PC3细胞有效结合。 利用MTT比色实验初步研究了scFv P-9对多种肿瘤细胞及正常肝细胞HL02的生物作用:scFv P-9不影响HL02细胞及恶性程度低的人前列腺癌细胞LNCaP的生长,但对人前列腺癌细胞PC3、人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞PLA801D细胞均有生长抑制作用;且孵育时间为24h时抑制细胞生长增殖的作用最突出。 在人宫颈癌裸鼠荷瘤模型体内验证了scFv P-9的抑瘤作用。PBS组宫颈癌移植瘤呈持续生长,scFv P-9处理组移植瘤生长受到明显抑制,尤其是瘤周皮下给药组更为显著,而非相关抗体处理组情况类似于PBS组。病理切片结果显示,scFV P-9处理组的肿瘤组织与PBS组相比,包膜完整、界限清晰,并有大片组织坏死;而非相关抗体组未见此现象。说明scFv P-9具有较好的抑瘤作用。 本研究获得的与人前列腺癌细胞系PC3结合特异性较高的单链抗体为前列腺癌的早期诊断与靶向治疗打下基础,并为进一步的研究提供依据。


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