收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

革耳(Panus rudis)漆酶的异源表达和酶学性质改良

杨建强  
【摘要】:漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,它的合成分泌存在有一系列的转译后加工过程(如糖基化等),一般认为漆酶蛋白的异源表达是比较困难。另外,漆酶的某些性质如氧化还原电位较低,高温易失活等也阻碍了它在实际中的应用。 野生革耳是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌,该菌产生的漆酶具有较好的热稳定性,是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。本研究中首先利用PCR扩增的方法在野生革耳漆酶基因lcc的3′端添加了编码5个氨基酸的酵母偏爱密码子,得到了改造的野生革耳漆酶基因lccT。将基因lcc和lccT分别连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,转化毕赤酵母进行分泌表达,获得了重组野生型漆酶LCC及其突变体LCCT。通过研究不同温度和铜离子浓度对漆酶表达活性影响的结果,当诱导培养温度为20℃,培养基中CuSO_4浓度为0.3 mM时漆酶的表达活性最高。在此条件下比较诱导表达的重组漆酶LCC和LCCT的活性,发现LCCT的最大酶活(192 U/L)是LCC的最大酶活(42.9 U/L)的4.5倍。这一结果表明漆酶C-端序列对其活性有较大影响。诱导表达漆酶LCCT经过分子筛和离子交换层析得到电泳纯的漆酶蛋白LCCT,pH4.5时的比活力为3.68 U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT的表观分子量为61.6 kDa。以ABTS为底物时的最适反应pH值为2.6,最适温度为45℃。氧化ABTS的K_m值为0.61 mmol/L,对应的V_(max)为12.21μmol/min。重组漆酶LCCT在60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活71%,50℃以下保温1h保留酶活均大于80%。 为了获得高活性的漆酶,我们利用定点突变和易错PCR的方法对基因lccT进行改造。 通过定点突变,使重组漆酶LCCT中第459位上的Asp(D)突变为Glu(E),得到的重组漆酶突变体LCCTM459纯化后的比活力在pH4.5时为8.54 U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT459表观分子量为61.5kDa,以ABTS为底物测得最适反应pH值为3.0,最适温度45℃。氧化ABTS的K_m值为0.16 mmol/L,V_(max)为20.04 μmol/min。重组漆酶LCCTM459在70℃保温10min酶活完全丧失,60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活14%,50℃以下保温1h保留酶活均大于50%,说明在50℃以下的温度重组漆酶LCCTM459的活性相对稳定,


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 付时雨,余惠生,王佳玲;漆酶-助剂体系催化氧化具有α-苄基氢的木素模型物[J];纤维素科学与技术;1999年01期
2 钞亚鹏,钱世钧;真菌漆酶及其应用[J];生物工程进展;2001年05期
3 吴鼎泉,王光辉,张磊,杜予民,屈松生;漆酶催化二氰基氢醌类化合物反应的微量热研究[J];武汉大学学报(理学版);1994年06期
4 侯红漫,周集体,陈丽;白腐菌漆酶特性及异生芳香化合物的降解[J];林产化学与工业;2003年01期
5 王宜磊,朱陶,邓振旭;彩绒革盖菌CV-8漆酶和多酚氧化酶活性[J];生态学杂志;1999年06期
6 朱显峰,杨生玉,沈永红,刘宇鹏,于成德,王俊芳,吴坤;漆酶检测方法的对比研究[J];河南大学学报(自然科学版);2002年03期
7 兰瑞芳,林少琴,林玉满,冯珊;杏鲍菇漆酶的生物学特性[J];食用菌学报;2002年02期
8 李冬生,康旭,杨红;漆酶固定化及其性质研究[J];广州食品工业科技;2004年02期
9 王宜磊,刘兴坦;彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性研究[J];生物技术;2000年06期
10 和文祥,蒋新,朱茂旭,王芳;酶修复土壤农药污染的研究进展[J];生态学杂志;2001年03期
11 涂楚桥,梁宏,王光辉;Cl~-、NO_3~-和SO_4~(2-)离子对漆酶催化活性的抑制作用[J];广西科学;1998年04期
12 王宜磊,杨道彩;云芝胞外漆酶活性研究[J];菏泽师范专科学校学报;1998年04期
13 任少亭,孙迅,毕瑞明;糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus SR-2)产漆酶条件及漆酶性质的研究[J];微生物学杂志;2000年02期
14 王宜磊,周长路;多孔菌Polyporus W38漆酶的纯化及性质研究[J];微生物学杂志;2002年06期
15 朱雄伟,胡道伟,梅运军,常天俊;通过碳源与氮源研究白腐菌产漆酶和菌丝体生长的相关性[J];微生物学杂志;2003年03期
16 王宜磊,刘兴坦;彩绒革盖菌漆酶产酶条件研究[J];植物学通报;2001年01期
17 吴坤,闵航,朱显峰,贾新成,张世敏,喻子牛;杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究[J];高校化学工程学报;2003年02期
18 王宜磊;毛栓菌漆酶诱导及部分特性研究[J];生物技术;2003年03期
19 钞亚鹏,叶军,钱世钧;担子菌组成型漆酶产生特性的研究[J];微生物学报;2000年06期
20 王宜磊;培养条件对毛栓菌漆酶分泌的影响[J];微生物学杂志;2003年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冯义平;毛亮;高士祥;;漆酶去除水体中四溴双酚A的研究[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
2 王宜磊;;产漆酶菌株筛选及其酶性质研究[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年
3 张晓昱;陈建伟;王宏勋;刘波;;不同黑液体系下白腐菌漆酶诱导分泌研究[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年
4 刘书钗;李彩霞;房桂干;;木聚糖酶和漆酶配合预处理纸浆的漂白性能研究[A];中国造纸学报2003年增刊——中国造纸学会第十一届学术年会论文集[C];2003年
5 杜红丽;王靖方;魏冬青;林影;;热带假丝酵母木糖醇脱氢酶定点突变设计的生物信息学分析[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
6 赵晗;卢丽丽;范树泉;肖敏;;短双歧杆菌α-半乳糖苷酶Aga2催化位点定点突变研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
7 王玉炯;许崇波;曾瑾;马春燕;李芳;;产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
8 张银波;江木兰;胡小加;马立新;;白腐菌漆酶基因的克隆及其在酵母中的表达研究[A];湖北省遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
9 牛静宜;王晔;陈鹏;王宜强;;重叠区扩增基因拼接法定点突变TGFBI及其真核表达载体的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
10 李凤;付时雨;詹怀宇;;硫酸盐桉木浆经漆酶体系脱木素及后续漂白的研究[A];中国造纸学会第十五届学术年会论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨建强;革耳(Panus rudis)漆酶的异源表达和酶学性质改良[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
2 姬广磊;漆酶在染料脱色和疏水性芳香化合物降解转化中的应用研究[D];山东大学;2009年
3 侯红漫;白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究[D];大连理工大学;2003年
4 周波;枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D];山东农业大学;2011年
5 王国栋;过量表达棉花分泌型漆酶拟南芥对酚酸类物质和三氯苯酚的植物体外修复[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
6 吴坤;杂色云芝(Coriolus Versicolor)和杂色云芝漆酶及其对环境污染物降解的研究[D];浙江大学;2002年
7 王会征;一种与聚羟基脂肪酸酯生物合成相关的新型水合酶结构生物学研究[D];山东农业大学;2013年
8 刘艳;嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA的外源表达与分子定向改造[D];四川农业大学;2012年
9 鲍文娜;Bordetella sp.BK-52顺式环氧琥珀酸水解酶催化作用的分子机制研究[D];浙江大学;2013年
10 高平挥;白念珠菌多药耐药蛋白Cdr1p构效关系研究[D];第二军医大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨欣;深海细菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜热脂肪酶的表达鉴定及体外诱变研究[D];厦门大学;2009年
2 杨登峰;新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计[D];广西大学;2005年
3 管海宏;天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的多反应性鉴定及其分子机制的初步探讨[D];第四军医大学;2005年
4 陈木妹;扩展青霉脂肪酶的定点突变[D];福建师范大学;2005年
5 吴倩倩;琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究[D];中国海洋大学;2008年
6 肖志广;鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究[D];中国农业科学院;2011年
7 陈国仁;扩展青霉脂肪酶的定点突变及随机突变[D];福建师范大学;2005年
8 郭娟娟;B10位突变对提高重组人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效率的研究[D];中国医科大学;2006年
9 李晨;一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性[D];山西大学;2006年
10 张洪喜;纤维素酶的定向进化、定点诱变及耐碱机理研究[D];山东大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张立国;自然不可改良[N];光明日报;2000年
2 约翰·吉布森;加拿大的生猪改良体系[N];中国畜牧水产报;2001年
3 高悦;城域网传输已改良[N];中国计算机报;2001年
4 张志刚;MPLS改良帧中继[N];中国计算机报;2002年
5 通讯员 周宇;曲松县改良牧业品种效益好[N];西藏日报;2002年
6 张新;改良国产狐与“洋狐”抗争[N];农民日报;2001年
7 李沙;改良资产 搞收藏[N];中国文化报;2001年
8 童铭;精品工程改良存储低端[N];中国计算机报;2002年
9 荆忠平;生猪改良应注意保护地方良种[N];中国畜牧报;2002年
10 荆忠平;生猪改良应注意保护地方良种[N];中国畜牧报;2002年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978