收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CHO-dhfr细胞改造的研究

许凌峰  
【摘要】:CHO-dhfr~-细胞表达体系是重要的药用蛋白表达体系,但其在培养过程中存在着一系列的问题,为了使其具有更适应大规模培养的特性,我们利用Flp定点整合系统,通过在CHO-dhfr~-细胞中稳定整合调控基因对CHO-dhfr~-细胞进行了的改造。首先在CHO-dhfr~-细胞中定点整合并过表达人抗凋亡基因Bc1-2,获得的重组细胞对诱导凋亡因素的耐受能力增强,凋亡水平降低,增加了对无血清和高氨离子浓度不利培养条件。乳酸是细胞的重要代谢产物,其积累可明显影响细胞的生长和对外源蛋白的表达。为了减少细胞内乳酸的积累,选择了四个CHO-dhfr~-细胞LDH-A基因中RNAi位点,设计了可转录产生相应shRNA片段的DNA序列,克隆于表达载体pAV/U6的下游。通过将shRNA表达载体在CHO-dhfr~-细胞中稳定整合使之持续表达针对CHO-dhfr细胞LDH-A基因的shRNA,在建立的四株重组细胞中,筛选到一株具有较低的乳酸脱氢酶的mRNA的细胞株,获得的重组细胞株CHO-shRNA能降低乳酸的产生和在培养基中的积累,使细胞的凋亡水平降低,提高了细胞贴壁培养密度11.4%。我们的第三方面工作是实现对细胞增殖进行调控,因为细胞在培养过程中的过度增殖不利于外源蛋白的产生,当细胞达到最佳密度后,生长的停滞将有利于提高外源蛋白的生产。为了实现对细胞生长调控蛋白P27表达的调控以实现细胞生长的停滞,利用T-REx~(TM)(四环素诱导)诱导表达系统,通过两步重组来达到建立稳定整合并可诱导表达p27基因的重组细胞株的目的,首先筛选了高表达TetR的重组细胞株,在此基础上,定点整合了受TetO_2调控之下的p27基因,以实现对p27基因的诱导表达和对细胞周期的控制,在p27诱导表达的情况下,有效的抑制细胞周期停滞于G1期,通过对EGFP检测,表明在细胞生长停滞条件下,细胞对外源蛋白的表达水平可提高70%。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 曾赵军,李昌琪,伍校琼,罗学港,曾志成;简易雪旺氏细胞培养方法及用于凋亡实验的研究[J];局解手术学杂志;2001年03期
2 唐丽;氯化锂对KT-1/A3细胞增殖和凋亡的影响[J];激光生物学报;2003年04期
3 王凡,何竟,羊惠君,李瑞祥;转化生长因子-β阻止肥大区和成骨区细胞[J];中国口腔种植学杂志;1999年01期
4 张嘉;TRAF2在TNF诱导细胞凋亡过程中的作用及其信号转导途径[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2001年04期
5 郭坤,赵刚,武志峰,窦梅,陈祥国,宫安静,朱丽;UVA对人角质形成细胞的氧化损伤作用[J];齐鲁医学杂志;2003年03期
6 陈晓波,王永潮;细胞周期检验点调控研究进展[J];科学通报;1998年07期
7 陈永昌,张建中,李铁,蒋秀高,朱文玉;幽门螺杆菌诱导人胃上皮细胞株BGC-823凋亡[J];中国应用生理学杂志;1999年03期
8 余振东!430022武汉,吴波!430030武汉,胡宏!630046重庆;脂多糖体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的研究[J];华中医学杂志;1999年06期
9 胡敏,李小锋,齐义鹏,刘德立;凋亡抑制基因p35对杆状病毒增殖的影响[J];武汉大学学报(自然科学版);2000年02期
10 夏革清;一氧化氮与妊娠免疫[J];国外医学.免疫学分册;2000年06期
11 刘艳梅,王殿华,李陈莉,王慧娟;核因子-κB调控PMN凋亡在急性肺损伤发病中作用的研究[J];中国科学基金;2001年02期
12 彭志勇;集落刺激因子与中性粒细胞的凋亡[J];国外医学.麻醉学与复苏分册;2001年03期
13 袁志强,彭毅志;热休克蛋白——细胞的内源性保护蛋白[J];生命的化学;2001年06期
14 聂亚雄;MAPK信号转导通路和Caspase-3,Akt与脑缺血损伤[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2001年03期
15 李忠香,王自能;人胎儿卵泡形成过程中卵细胞的凋亡[J];郑州大学学报(医学版);2004年02期
16 谭赛男;陆彩玲;崔熠;马旭;;槲皮素对结肠癌细胞生长的影响[J];细胞生物学杂志;2008年01期
17 李小平;陈瑞珍;宿燕岗;陈灏珠;李浪;刘唐威;伍伟锋;;柯萨奇病毒B3诱导HeLa细胞凋亡[J];中国临床医学;2011年01期
18 肖冰,周殿元,姜泊,谭晓华;IL-6转基因表达诱导大肠癌细胞凋亡[J];细胞与分子免疫学杂志;1998年01期
19 刘红涛,王玉刚,张颍妹,宋泉声,狄春晖,陈光慧,汤建,马大龙;凋亡相关新基因 TFAR19 的 cDNA 克隆、表达和功能研究[J];高技术通讯;1998年05期
20 高临路,崔玉芳;Fas/Apo-1(CD95)系统与细胞凋亡研究新进展[J];国外医学.免疫学分册;1999年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 俞松;曹江;;重组人血管内皮抑制素对血管瘤内皮细胞作用的实验研究[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年
2 蔡久英;张博;;红景天苷对乳鼠心肌细胞凋亡的影响[A];第八次全国中西医结合心血管病学术会议论文集[C];2007年
3 王继明;吴以岭;杨萍;宋林;;肌萎灵注射液对运动神经元保护作用的实验研究[A];中华中医药学会老年神经病专题学术研讨会论文专辑[C];2006年
4 高玉环;黄晨;刘丽宏;;B淋巴细胞刺激因子对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226生长调控的研究[A];第三届中国肿瘤内科大会教育集暨论文集[C];2009年
5 高玉环;黄晨;刘丽宏;刘海生;;B淋巴细胞刺激因子对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226生长调控的研究[A];第五届全国中医药免疫学术研讨会——暨环境·免疫与肿瘤防治综合交叉会议论文汇编[C];2009年
6 周军兰;梁建辉;郑继旺;;神经生长因子对甲基苯丙胺所致R2细胞损伤的影响[A];第七届全国药物依赖性学术会议论文摘要汇编[C];2003年
7 魏永祥;韩德民;蔡贞;杨凌;刘小超;羡慕;张晓斌;;嗅感觉神经细胞的分离与培养[A];第七届北京青年科技论文评选获奖论文集[C];2003年
8 胡秀华;;细胞培养与real-time RT-PCR相结合的方法检测水体中感染性轮状病毒[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
9 石旭东;甘志华;;细胞培养用聚乳酸多孔微载体的制备及改性研究[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
10 周海文;周曾同;商庆新;曹谊林;;正常人口腔粘膜角化细胞体外培养研究[A];第一届全国口腔颌面部肿瘤学术会议论文汇编[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 许凌峰;CHO-dhfr细胞改造的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
2 崔侨;冬凌草甲素诱导人肿瘤细胞自噬与凋亡关系的研究[D];沈阳药科大学;2007年
3 磨美兰;PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈功能的影响[D];中国农业大学;2005年
4 朱丽君;用核苷酸干扰技术抑制纤维母细胞生长因子第三型受体在多发性骨髓瘤中的表达及受体功能研究[D];浙江大学;2005年
5 王旭;涎腺多形性腺瘤基因治疗的实验研究[D];河北医科大学;2005年
6 黄立军;α_1抗胰蛋白酶在肺癌发生发展中的作用[D];第四军医大学;2005年
7 郑联合;阿霉素联合微波诱导成骨肉瘤细胞凋亡分子机制的初步研究[D];第四军医大学;2005年
8 宋维亮;活体小肠移植的临床及基础研究[D];第四军医大学;2005年
9 张卫东;斑蝥素对肺癌A549细胞增殖抑制作用机制的研究[D];中国医科大学;2005年
10 佡剑非;Aβ-AD动物模型建立及NGF治疗的实验研究[D];中国医科大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋爱萍;肿瘤坏死因子α对体外培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的诱导[D];青岛大学;2005年
2 张志平;鹿茸多肽对体外兔关节软骨细胞凋亡与增殖的影响[D];江西医学院;2005年
3 陶杨娟;油桐尺蠖核型多角体病毒p35基因的研究[D];南京师范大学;2005年
4 沈文;IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、anti-IGF-IR对人肾上腺皮质癌SW-13细胞株生长及凋亡的调控[D];第一军医大学;2007年
5 徐兴华;氨氯地平对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外作用研究[D];重庆医科大学;2008年
6 王超;染料木素对Aβ25-35诱导大鼠胚胎海马神经元凋亡的神经保护作用[D];第四军医大学;2009年
7 李雪玲;川芎嗪对急性缺血诱导的大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[D];兰州大学;2006年
8 谢宝明;阿司匹林对大鼠皮质神经元缺氧缺糖再灌注损伤保护作用的研究[D];山西医科大学;2008年
9 王晨;成熟心肌细胞异体移植对心肌梗死后心功能的保护作用[D];第四军医大学;2005年
10 胡亮;小鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞[D];西北农林科技大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 殷永哲;核酸与细胞的生理性凋亡[N];保健时报;2009年
2 刘霞;英利用细胞切除技术降低制药成本[N];科技日报;2008年
3 葛秋芳;美科学家培育出修理心脏的“导线”[N];新华每日电讯;2006年
4 ;用人类自体细胞培养心脏[N];中国中医药报;2000年
5 钱铮;日本用鼠肝和胃细胞培养出诱导多功能干细胞[N];新华每日电讯;2008年
6 栾雪梅;减轻溶血 提高生活质量[N];医药经济报;2004年
7 记者 刘道安;天津医生建立细胞培养模型[N];健康报;2001年
8 齐智杰 记者  何秀丽;三个自主创新项目获科技进步一等奖[N];哈尔滨日报;2006年
9 厉锋;薄利时代的“重金”之忧[N];中国医药报;2006年
10 吉恩;FDA颁布指南加速流感疫苗开发[N];中国医药报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978