骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化及对糖尿病治疗作用的研究

【摘要】：对于胰岛细胞功能受损的糖尿病(Ⅰ型及部分Ⅱ型)患者来说,植入胰岛β细胞或其替代物是一个很理想的治疗手段。近年来,经门脉胰岛细胞移植技术在临床上已有开展。但细胞来源不足及严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的广泛应用。干细胞作为一类具有极强自我更新及多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。 大量研究表明骨髓干细胞具有多向分化潜能,它们可以分化成心肌细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、神经细胞等。骨髓干细胞能否分化为胰岛细胞,从而成为糖尿病细胞治疗的种子细胞是本课题想解决的问题。为此,我们首先构建了链脲霉素导致的小鼠胰腺损伤模型(糖尿病模型),然后将分离的骨髓干细胞或间充质干细胞(分4次)经腹腔或尾静脉注射到糖尿病小鼠体内。在移植细胞后定期检测各移植组的小鼠的血糖值,结果显示各糖尿病小鼠的高血糖状态无明显缓解。表明移植的骨髓干细胞并不能发挥细胞治疗作用。在植入细胞后3、4、6、9、12周时分别取胰腺组织作冰冻切片或石蜡切片,利用雌雄标记法进行Y染色体原位杂交,或荧光显微镜直接观察预先经DAPI标记的细胞。原位杂交结果显示移植细胞散在分布于胰腺组织中;通过荧光显微镜观察胰腺冰冻切片,也可检测到DAPI标记的外源细胞。从形态来看,多数细胞分化成腺泡细胞或导管细胞,结合胰岛素的免疫荧光染色未检测到胰岛素阳性的细胞。这些结果表明在胰腺损伤的情况下移植的骨髓干细胞可以定居到胰腺,但并不能分化为胰腺β细胞。分析原因可能与小鼠的高血糖状态不利于移植的细胞向胰岛样细胞分化,或者由于外源细胞分化为胰岛细胞的数量较少,长期高血糖导致这些胰岛细胞功能代偿而再次受到损伤。 鉴于骨髓干细胞移植实验并没有取得治疗效果,我们考虑选择骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)进行体外扩增、定向诱导分化,然后植入糖尿病小鼠体内观察它们的治疗效果。选择MSCs作为种子细胞,是因为它本身具有很多优势,如易于分离培养扩增,遗传背景稳定,体内植入反应较弱,在特定的诱导条件下可分化为多种中胚层组织细胞,如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞,并可跨胚层分化为神经细胞等。本研究根据胰腺与神经系统具有相似发育机制的特点,设计了诱导hMSCs向胰岛样细胞分化的条件。首先利