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靶向HER-2的siRNA治疗乳腺癌的实验研究

吴峰  
【摘要】:HER-2(c-erbB-2,neu)基因是EGF受体家族的重要成分,它在20%~40%的乳腺癌中高表达,并与乳腺癌的发生、转移、预后密切相关。HER-2高表达的乳腺癌患者采用化疗、放疗、内分泌治疗及联合治疗等多种治疗手段无显著疗效,且预后不良。目前,HER-2基因或p185~(HER-2)蛋白已经成为乳腺癌治疗的理想靶点。其中人源化单克隆抗体Herceptin(赫赛汀)是第一个针对HER-2阳性转移性乳腺癌的治疗药物,也是第一个靶向乳腺癌的生物治疗药物,已被批准用于临床,并取得令人鼓舞的疗效。但抗体药物作用于p185~(HER-2)蛋白,并不能从根本上抑制HER-2基因的表达。而基于反义技术的基因治疗则可以更直接、更有效地抑制HER-2基因的表达。目前,针对特定基因mRNA的RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术为基因治疗提供了新方法。RNAi药物可以有选择地使目标基因失活,并克服蛋白质药物的诸多缺点。虽然对RNAi药物的研究才刚起步,但已取得很大进展。本研究的目的就是找到具有较好干涉效果的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA),实现对乳腺癌细胞中HER-2表达的高效抑制,并最终用于对HER-2高表达乳腺癌的基因治疗。 首先,通过GenBank获得了6条人HER-2 mRNA序列,其中被研究较多的是长度为4624bp的HER-2 mRNA序列(序列号为NM_004448.2),与其它HER-2 mRNA序列都具有较高的同源性,且其编码区(coding DNA sequence,CDS)也最完整。因此,我们以4624bp HER-2 mRNA为靶序列,从mRNA序列的AUG起始密码子开始,在编码区内寻找“AA”二核苷酸序列,并且选择GC含量在40%~50%的序列,最终设计了5条siRNA。并构建了表达发夹siRNA的质粒载体pSilencer-HER-2,将质粒转染MCF-7乳腺癌细胞,经筛选得到5种稳定表达发夹siRNA的细胞株。然后。分别在mRNA和蛋白水平上检测了siRNA对HER-2表达的抑制作用。结果显示,5条siRNA均能明显降低细胞中HER-2 mRNA的表达,其中3P的抑制作用最强。通过流式细胞术检测了稳定表达siRNA细胞表面HER-2蛋白的表达水平,检测结果表明,稳定表达siRNA的2P和3P转染细胞表面HER-2的表达被明显抑制。将这些稳定表达siRNA的细胞株接种裸鼠进行成瘤性实验,结果表明,与转染对照质粒的MCF-7细胞相比,稳定表达siRNA的MCF-7细胞的成瘤性均有所降低。通过免疫组化检测瘤组织中HER-2蛋白的表达,结果显示,稳定表达siRNA的MCF-7细胞形成的肿瘤组织中HER-2蛋白的表达也被明显抑制。 我们还对长度为4624bp的HER-2 mRNA进行了二级结构模拟,分析了siRNA靶序列位点的局部二级结构,希望能够找到靶序列二级结构与siRNA干


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