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抗B型肉毒毒素鼠源中和抗体快速制备及其免疫学活性的初步研究

杨秀清  
【摘要】:肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,属神经强毒,人类的肉毒中毒主是由A,B和E引起。是目前已知毒性最强的细菌蛋白质之一,是重要的生物战剂。本论文以定向免疫和噬菌体展示技术为平台,探索了一种快速制备及筛选鼠源抗体的技术路线,将筛选到的高亲和力抗体直接进行中和活性实验,将抗体基因克隆、高亲和力抗体富集和抗体筛选在噬菌体水平一步完成,简便快速,研究周期短。为生物毒素新型抗毒素的制备提供新的研究思路。 本研究中首先克隆了B型肉毒毒素重链C端基因,与已知序列同源性达99%。为了获得重组蛋白,构建了pET22重组质粒载体,诱导表达后未得到目的蛋白。随后构建pET32重组质粒,获得了BoNTB/Hc的融合蛋白。对引物进行改构后,最终获得了以包含体形式存在的BoNTB/Hc N端修饰蛋白,并用金属螯和层析法进行了初步纯化和鉴定。进一步对其免疫学活性进行初步研究,结果表明重链Hc免疫后的BALB/c小鼠可以在一定程度上抵抗6×10~3 LD_(50) B型肉毒毒素攻击,为B 型肉毒毒素疫苗的研究奠定了基础。同时制备了卵黄检测抗体(IgY),抗体效价达10~4以上。 用重组表达并纯化的BoNTB/Hc免疫小鼠,从其脾淋巴细胞中提取全套抗体可变区基因,分别构建scFv和Fab段噬菌体抗体文库,库容分别为6.72x10~7cfu和5.69x10~6cfu。以纯化的BoNTB/Hc为抗原,对抗体库进行富集筛选,并以BoNT/B为抗原进一步鉴定特异性抗体,最终获得与BoNT/B结合能力较强的scFv抗体2个,分别命名为S3和$24,VH属于VH2家族,VK分别属于VK2和VK1家族。Fab抗体1个,命名为F38,VH属于VH1家族,VK属于VK2家族。 重组抗体免疫学保护试验表明,抗B型肉毒毒素的噬菌体抗体S3对BoNT/B致死作用的保护性较强,能够在一定程度上抵抗10LD_(50)(i.p.)的致死作用,S24次之,F38较弱。未观测到S3,S24和F38三者的明显叠加作用。挑选作用较强


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