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人IL-6高亲和力拮抗肽的合理设计及功能评价

杨镇珲  
【摘要】:hlL-6是一种多功能的细胞因子,在诸多疾病的发生、发展过程中起着至关重要的作用。近年来,随着对大量分子生物学突变实验和晶体衍射结果的分析,科研工作者们不仅预测出了hIL-6/hIL-6R相互作用的重要功能活性位点,而且还根据这些相互作用的重要功能位点设计出了一系列有效的针对hIL-6的拮抗剂。本研究基于hIL-6/hIL-6R复合物的晶体结构,从理论上选定重要的功能活性位点(hIL-6的AB环以及螺旋-A、D的C末端)为靶标,合理设计出具有潜在功能的hIL-6拮抗肽,并选择XG-7、M1细胞对其拮抗功能进行评价。 (1) 基于hIL-6/hIL-6R复合物的晶体结构合理设计hIL-6拮抗肽 基于hIL-6/hIL-6R复合物的晶体结构,从理论上确定hIL-6与hIL-6R相互作用的重要区域。以hIL-6AB环区和螺旋A、D的C末端和为靶标,合理设计出hIL-6拮抗肽PT。理论分析结果表明,拮抗肽PT在体外能够有效地模拟hIL-6的作用竞争结合hIL-6R。 (2) hIL-6R胞外段及突变体蛋白的表达、纯化、功能及拮抗肽PT竞争hIL-6结合hIL-6R的评价 以cDNA-514为模板,将hIL-6R胞外段基因hIL-6R-EC05和缺失突变体hIL-6R-EC70(缺失Ig区)定向克隆到原核表达载体pET32a(+)中,IPTG诱导表达后经Ni~(2+)整合柱纯化,通过Western blot进行鉴定。ELISA结合实验证实Ig区在hIL-6R中仅起到稳定蛋白结构的作用,对于hIL-6和hIL-6R的作用影响不大。竞争ELISA结合实验表明,拮抗肽PT在体外能够有效地模拟hIL-6的


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