抗乙型肝炎病毒药物的筛选和研究

【摘要】：目的 (1)利用HepG2.2.15细胞培养体系,以HBsAg和HBeAg为指标对样品库(包括天然产物单体和粗提物)进行体外抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)活性筛选;(2)对筛选出有活性的化合物,进行初步构效关系探讨。检测HBV DNA拷贝数,初步研究其作用机制;(3)同时建立一种检测HBV cccDNA的方法,研究抗HBV药物的作用机制和作用特点。 方法 选用阿德福韦酯为阳性药,用MTT法检测样品对HepG2.2.15细胞的毒性,ELISA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的变化,以细胞的半数毒性浓度TC_(50)、半数抗原分泌抑制浓度IC_(50)、治疗指数TI(TI=TC_(50)/IC_(50))为指标,对本实验室化合物库358个天然产物进行初筛,筛选出抗HBV的活性化合物。对初筛有活性样品,进一步复筛确认。选择两类代表性的活性化合物:白藜芦醇(resveratrol,反式3,4’,5-三羟基-二苯乙烯)和黄酮类化合物(flavonoids,以C6-C3-C6为母体结构)进行初步构效关系研究。合成和收集白藜芦醇衍生物15个,黄酮类化合物及其衍生物16个。用实时荧光定量PCR法(Taqman探针法)观察白藜芦醇及其衍生物与黄酮类化合物对HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数的影响。流式细胞仪检测白藜芦醇对HepG2.2.15的调亡作用,进一步探讨白藜芦醇抗HBV机制。另外,本课题进行了干复津、聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液(PEG-IFNSA)体外抗HBV的研究。 建立检测HBV cccDNA的方法简述如下:构建HBV cccDNA质粒作为标准品,用实时荧光定量PCR法(SYBR Green Ⅰ染料法)对HBV cccDNA进行绝对定量,观察干复津、PEG-IFNSA对HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的影响。 结果 (1)阳性药阿德福韦酯对HepG2.2.15细胞的半数细胞毒性浓度TC_(50)为42.4±5.2μg/ml,抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg的半数浓度IC_(50)分别为17.2±2.1μg/ml和84.8±4.3μg/ml,治疗指数TI分别为2.5±0.2和0.5±0.2。 (2)样品的筛选。对358个天然产物进行820样品次初筛和复筛,共筛选出68个化合物TI在1～2之间,60个化合物TI在2～10之间,26个化合物TI≥10。 (3)白藜芦醇及其衍生物在体外抗HBV作用。白藜芦醇的TC_(50)为