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中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与全基因克隆

吴健敏  
【摘要】:临床上,供体器官的严重短缺,使人们将目光转向了异种移植。目前为止,猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现,以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在体外能够感染多种人源细胞,这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。我国有着丰富的小型猪种资源,目前已经开展猪-人异种器官/组织移植的相关研究,但有关小型猪中PERV的携带、表达情况以及内源性释放毒株的生物学特性方面报道甚少,因此有必要开展这方面的研究工作,了解我国小型猪中PERV存在的本底,为异种器官受体提供安全可靠的器官,同时通过构建细胞感染模型与全基因克隆,为进一步研究PERV的生物学特性及PERV对人源细胞的感染机制搭建技术平台。为此本研究主要进行以下四个方面的工作: (1) 中国特有小型猪PERV存在情况的普查 采集了6个省市10个单位、5个品种、17个猪群259份血样,通过PCR检测发现:我国小型猪基因组中普遍存在PERV,其阳性率达100%。其中以B亚型最高(95.37%),其次为A亚型(67.18%)、C亚型(42.08%),目前为止没有筛选到无PERV的阴性猪个体。PERV主要结构蛋白基因gag、pol、env不仅在小型猪基因组中存在,而且都能够转录为RNA。除了检测不到PERV-C亚型病毒的表达外,大部分A、B亚型病毒都能够表达,且A亚型的表达率高于B亚型。值得注意的是我国小型猪中各种PERV亚型病毒混合存在的现象十分普遍,有78.38%存在2种以上PERV亚型病毒混合感染,因此小型猪中存在不同PERV亚型病毒重组的可能性。 (2) 不同PERV HEK293细胞感染模型的建立 利用本实验室已经建立的G418抗性HEK293细胞(G418~R293),将五指山猪(WZS)、中国实验小型猪(ZGSY)、巴马香猪(BMXZ)、巴马小型猪(BM)及贵州香猪(GZ)外周血淋巴细胞分别与G418~R293细胞共培养,通过G418加压筛选,除去共培养体系中的猪外周血淋巴细胞,然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。通过上述方法已成功建立了5个来自小型猪外周血淋巴细胞的PERV HEK293细胞感染模型,证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系,为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台。 (3) PERV-WZS株等病毒全基因组序列测定 本研究利用PCR及RACE技术完成了五指山小型猪、巴马小型猪及来源于HEK293细胞感染模型的猪内源性反转录病毒的全基因组序列测定,3个毒株的大小分别为8639 bp、8595 bp、8689 bp。分型检测均为PERV-A亚型病毒。遗传


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