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微丝相关新基因hHBrk1的克隆及功能鉴定

徐勤枝  
【摘要】:细胞形态的变化可影响细胞内大分子的代谢。细胞骨架对于细胞形态的维持起着主导作用,细胞表面的接触和细胞形态的改变,都是通过细胞骨架成分,把信息传导至核内而引起细胞一系列生物化学反应。微丝为直径6nm的细丝,是细胞骨架的成分之一。微丝在细胞形态和运动的调节蛋白与执行蛋白之间,搭建起一机械支架结构,参与维持细胞的形态、肌肉收缩、细胞运动、物质运输等生命活动,另外完整的微丝骨架是细胞内源性信使协调作用的基础。 在恶性转化的细胞中,细胞常表现为细胞骨架的破坏和微丝的异常聚合。肿瘤细胞的浸润、转移与微丝及其相关蛋白的表达改变有关,微丝的异常聚合可增强肿瘤细胞的运动能力。因此深入研究肿瘤浸润、转移的机制,寻找新的肿瘤运动相关基因,可为肿瘤的生物治疗提供治疗靶点。本研究室以永生化人支气管上皮细胞BEP2D和恶转的BEPR35为研究对象,采用抑制性削减杂交和基因芯片技术,筛选到一在肿瘤中高表达的新基因序列表达标签(EST)。本实验采用生物信息学、RACE、Northern印迹杂交、GST pull-down、免疫共沉淀等技术,克隆了该基因,将之命名为hHBrk1,并对其功能进行了初步鉴定。实验分三部分内容:1.hHBrk1基因的克隆和生物信息学分析;2.hHBRK1蛋白的细胞定位研究;3.hHBRK1相互作用蛋白的鉴定。 第一部分 hHBrk1基因的克隆和生物信息学分析 应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从人的胎脑文库中克隆了hHBrk1基因,并将它提交到Genbank中,序列号为AY148219和AY148220。生物信息学分析发现hHBrk1基因位于3号染色体短臂的25.3-24.1区,由3个外显子和2个内含子组成,编码75个氨基酸,分子量约9KD。Northern印迹杂交结果表明,hHBrk1基因在人体12种正常组织中均有表达,尤以心肌和骨骼肌为著。在人的胎脑、胎肝、胎肺和胎肾组织中表达丰度相似。同时Northern印迹杂交显示hHBrk1基因有2个转录本,分别为1.1 Kb和1.4 Kb,与RACE的结果相符。 hHBRK1蛋白家族保守性很强,与小鼠的同源蛋白只有1个氨基酸的差异,同源性达98%,与植物界相关蛋白的同源性达35%,提示hHBRK1蛋白为一在动植物界高度保守的小分子蛋白质。应用PAIRCOIL软件发现,hHBRK1蛋白家族存在一七重复(heptad repeat,HR)结构域。HR结构域的特征为氨基酸每七个一组,分别命名为“abcdefg”,其中“a”和“d”位上的氨基酸均为疏水性的亮氨酸、异亮氨酸或其他疏水性的氨基酸。HR结构域可形成特殊的α螺旋,即卷曲螺旋(coiled-coil),这个特征为微丝相关蛋白


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