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金属结合肽的噬菌体随机肽库筛选和酵母细胞表面展示

茆灿泉  
【摘要】:包括放射性核素在内的重金属污染一直是世界普遍存在的环境问题,采用生物修复(Bioremediation)的方法可望实现环境污染物的有效、简便和低费用防治,促进社会与经济的可持续发展。考虑传统的生物(微生物)修复技术常常不能满足重金属污染治理的要求,与生物文库和细胞表面展示相关的微生物基因工程技术引起了广泛的关注。最近的研究显示,研制重金属高效结合肽展示的微生物工程菌,有望在重金属修复,尤其在大流域低浓度有害的重金属污染治理中发挥重要作用。 目前用于微生物展示的金属结合肽主要来源于6×His类的金属结合肽、天然金属结合蛋白或其结构域的模体以及肽库筛选等;而宿主微生物主要集中在各种细菌(包括G~-和G~+)。通过细菌表面展示和工程细菌的重金属结合试验,已显示微生物工程菌在重金属修复中的潜在作用。考虑噬菌体随机肽库技术在配基筛选中的巨大潜力和酵母菌的安全性以及其本身对重金属的高吸附能力,我们就金属高效结合肽的筛选和微生物表面展示开展了以下方面的工作: 首先应用固定化金属离子亲和层析(IMAC)树脂和噬菌体肽库展示技术,就丝状噬菌体肽库对重金属离子(Co~(2+);Ni~(2+))的结合特性进行了研究。采用分段筛选和梯度洗脱的方法从丝状噬菌体随机十二肽库中筛选和富集金属结合肽,同时研究了不同区段和洗脱浓度对噬菌体P/N值(金属螯合树脂咪唑(ID)洗脱液的噬菌体滴度/去除金属离子的螯合树脂ID洗脱液的噬菌体滴度)、相对富集水平以及噬菌体克隆数的影响。结果显示:随着筛选轮数的增加,各ID洗脱浓度下的噬菌体P/N值呈现增长的趋势;对于不同区段(20-100;100-200;200-400 mmol/L的ID浓度)、不同浓度(100;200:400 mmol/L的ID)以及每一轮筛选,均以在100 mmol/L的ID洗脱浓度下的噬菌体克隆数为最高;并且,收集的各段噬菌体用三种浓度的ID洗脱,呈现各洗脱浓度下的噬菌体相对富集,这种克隆数的相对富集与噬菌体的P/N值增减趋势具有一定的相关性。 在此基础上对结合有噬菌体肽库的Co~(2+)离子螯合树脂用200 mmol/L的ID直接进行淘洗,经五轮筛选,噬菌体文库的P/N值从1.4倍提高至140倍,从第3,4,5轮以及前述不


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