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低氧对神经干细胞增殖和分化的影响及HIF-1的作用机制

张翠萍  
【摘要】:神经干细胞(neural stem cell,NSC)是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的神经前体细胞。它能最终分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,因此对治疗神经退行性疾病和损伤有着广阔的应用前景,目前已成为神经系统领域的研究热点。而氧是生命存在的必要条件,也是细胞生理功能的一种重要调节因子,氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。目前关于低氧作用的研究多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面,而关于低氧在细胞增殖和分化中的作用研究较少,特别是关于低氧对NSCs增殖和分化的影响目前还不太清楚。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是细胞低氧反应的核心调控因子,诸多研究表明它在肿瘤细胞增殖中起着重要的调控作用,但关于它是否参与低氧对NSCs增殖和分化的影响国内外未见报道。因此本研究利用各种细胞分子生物学手段,比较了不同氧浓度对NSCs增殖和分化的影响,观察了低氧后NSCs内HIF-1α的表达变化,并探讨HIF-1α在低氧引起的NSCs增殖和分化中的作用。 一、神经干细胞分离、培养和鉴定以及低氧浓度测定 Wistar孕大鼠(E13.5d)戊巴比妥钠麻醉后,无菌条件下取出胎鼠,分离胎鼠中脑NSCs。传3代后,制成单细胞悬液,在涂有多聚赖氨酸(0.1mg/mL)的confocal皿中贴壁半小时,4%多聚甲醛固定后,用免疫组化进行Nestin鉴定,鉴定结果表明几乎所有细胞均为Nestin染色阳性,说明我们培养的NSCs较纯,可用于下面的实验。 我们把通过以上方法得到的NSCs分别置于不同环境氧浓度中(20% O_2,10% O_2,3% O_2,0% O_2),培养3d后,分别用血气分析仪和自动生化分析仪测定细胞培养上清中的氧分压和乳酸浓度。氧分压依次为153±7、105±5、80±10和65±15mmHg;乳酸浓度依次为0.875±0.251、1.425±0.112、1.825±0.220和2.096±0.233mmol/L。由以上结果可以看出,随着环境氧浓度的下降,细胞培养上清中的氧分压随之下降,而乳酸浓度随之增高,在环境氧浓度为0% O_2时,细胞培养上清的乳酸浓度达2.096mmol/L。乳酸浓度过高不利于细胞生长,因此在以下的实验中,我们采用10%和3%氧浓度来观察低氧对NSCs增殖和分化的影响。


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