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间充质干细胞分离、扩增及定向成骨分化的蛋白质组学分析

刘元林  
【摘要】: 目的:探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞(MSC)定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变。 方法:从人骨髓细胞中分离获得MSC,经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSC的纯度和功能后,采用定向成骨细胞分化诱导培养体系,于分化后14天分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白,双向电泳分析,确定蛋白差异点,经酶切后行蛋白肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting)鉴定差异蛋白表达。 结果:自骨髓中成功分离获得间充质干细胞,细胞形态均一,为典型的纺锤状,大约14d有超过80%的细胞融合。细胞表型分析为SH-3、4(CD73)、SH-2(CD105)、间质细胞标志CD166阳性,造血细胞表面标志CD34、CD45阴性,纯度在90%以上。细胞周期分析表明,只有3.2%的细胞处于活跃的增殖分裂期即S期,90%的细胞处于静息期即G_0-G_1期。细胞在特定诱导条件下可分化为多种间质细胞,如向脂肪分化,细胞内有脂滴的形成;向成骨分化,碱性磷酸酶表达增加,培养3w,可见骨结节形成;向成软骨分化,Collagen-Ⅱ表达阳性。RT-PCR检测特异性表达产物,进一步从分子水平证实所获得MSC的多向分化潜能。运用双向电泳实验技术,观察到MSC与成骨细胞凝胶图像存在多个蛋白差异点,挑出其中的38个蛋白差异点,经过胶内酶切,质谱分析,共鉴定出24个差异蛋白分子表达。 结论:用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSC定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白。


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