我国中部农村HIV-1耐药性及分子进化规律研究

【摘要】： 到目前为止，我国已经进行了较大范围HIV-1耐药性的横断面监测，但缺乏深入的队列和进化规律研究，对HIV-1耐药性发生和发展的规律性及耐药毒株的生物学特点还没有足够的认识，在抗病毒药物的使用和临床治疗方面存在着较大的盲目性。本研究通过对河南省部分地区接受规范性抗病毒治疗的患者进行队列研究，阐明抗病毒治疗后HIV—1耐药性的流行状况、揭示耐药突变的发生和演变规律，以及耐药性对抗病毒治疗效果的影响。 第一部分我国中部农村HIV-1耐药发生和演变的队列研究 从2004年3月开始对河南省某地76名接受免费抗病毒治疗的艾滋病患者进行前瞻性队列研究，该队列的抗病毒治疗方案为两种核苷类逆转录酶抑制剂(AZT+ddI)加一种非核苷类逆转录酶抑制剂(NVP)。治疗期间共随访6次，随访时间2.5年。每次随访均进行抗病毒治疗相关的问卷调查，并采集外周静脉血进行CD4~+T淋巴细胞计数、病毒载量测定和基因型耐药性检测。6次随访共收回调查问卷427份，采集EDTA抗凝血427份。通过随访表的统计分析获得病人的人口统计学特征、药物副反应和服药依从性；通过CD4~+T细胞计数和病毒载量了解患者病毒抑制和免疫功能恢复情况；通过基因型耐药性结果了解耐药突变的特征和对药物的敏感程度。将6次的结果对比研究，阐明HIV-1耐药性的流行情况，揭示HIV-1耐药性的发生和演变规律。主要结果如下： A．在随访过程中，至少对一种药物产生耐药的患者比例高达78.9％。首次发生耐药的时间集中在抗病毒治疗开始后的18个月内。 B．研究队列在随访期间对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)的耐药流行率在6.6～23.7％之间，对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)的耐药流行率在13.2～42.1％之间。对两类药物耐药的流行率呈总体上升趋势。 C．在随访期间共出现17个与NRTIs耐药有关的突变位点。其中包括胸苷类耐药突变(TAMs)：M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y、K219Q；Q151M突变复合体：V75I、F77L、F116Y和Q151M；T69S-SS插入突变；因ddI治疗产生的K65E、L74V、M184V/I等突变，以及E44D、V118I等其他次要耐药突变位点。TAMs是导致NRTIs耐药的主要突变位点，在整个治疗过程中呈总体上升趋势。其他突变位点发生频率较低，持续时间较短。与NNRTIs耐药有关的突变位点共有15个。最主要的3个耐药突变位点是：K103N、Y181C和G190A，这3个突变的发生频率较高，并呈持续上升的趋势。 D．耐药人群对AZT的耐药以中、高度耐药为主，对ddI以低度耐药为主，对NVP以高度耐药为主。对AZT和ddI耐药的患者同时对NRTIs类中的ABC、d4T、TDF也产生了交叉耐药，携带V184V/I突变的患者对3TC和FTC产生了低度耐药性。对NVP高度耐药的患者对NNRTIs类的其他两种药物DLV和EFV也产生了高度耐药性。28.9％的患者同时对NRTIs和NNRTIs两类药物产生了多重耐药性。 E．服药依从性是耐药发生的主要影响因素。依从性和耐药发生率的关系在治疗前、后期呈现出不同的规律。在治疗前期(3～12个月)，依从性和耐药的发生率呈“钟形”曲线关系，即服药依从性好(＞90％)和差(＜50％)的患者耐药发生率均很低，服药依从性中等(75～90％)的患者耐药发生的几率最高。在治疗后期(18～30个月)，依从性差的患者耐药发生率依然较低，而依从性好和中等的患者发生耐药的几率都很高。 F．治疗30个月时所有患者的CD4~+T细胞计数均值较治疗3个月时降低了215 cells/ml。病毒载量对数均值下降了0.2 log copies/ml。在整个治疗过程中，对药物敏感患者CD4~+T细胞计数均值与耐药患者没有显著性差异。耐药患者的病毒载量对数均值显著高于敏感患者。 G．治疗过程中，耐药患者的平均HIV RT基因离散率显著高于敏感患者和中断治疗患者。携带的耐药突变越多，基因离散率越高。 第二部分HIV—1耐药性的选择动力学研究 以耐药研究队列中4名服药依从性较好，在治疗初期为野生型毒株，在以后的治疗过程中逐渐发生NRTIs和NNRTIs双重耐药突变的患者为研究对象，对每位患者4～5次随访血浆样本的RT基因进行克隆分析。每个样本挑取150～250个克隆进行序列测定，逐一对每个序列进行分析和整理，将最终获得的855个克隆的序列与斯坦福大学HIV-1耐药数据库进行比对，获得所有克隆序列的基因型耐药性特征。通过对每个患者不同治疗时间所有克隆的基因型特征进行分析研究，阐明NRTIs和NNRTIs类耐药突变发生的选择动力学特征，揭示我国HIV—1耐药毒株进化演变的规律。主要结果如下： A．NRTIs类耐药突变是一个逐级累加的过程。在所选的4例患者中，NRTIs类耐药突变表现出三种不同的发生演变途径： 一是．TAMs-1型，从野生型开始逐个累加TAMs-1的典型耐药突变，先形成以M41L,L210W,T215Y为主的TAMs典型耐药突变组合，之后继续累加次要耐药位点，最终在治疗30个月时形成携带6个TAMs-1的突变形式。 二是TAMs-2型，治疗3个月时从D67N，K70R突变开始累加其他耐药突变，治疗24个月时形成D67N,K70R,K219Q的典型TAMs-2突变位点组合。之后继续累加其他突变位点，形成更复杂的TAMs-2突变形式。 三是TAMs-1和TAMs-2融合型：首先在治疗12个月时分别形成M41L，T215Y的TAMs-1突变和D67N，K70R的TAMs-2突变，治疗30个月时二者加合为M41L，T215Y，D67N，K70R的TAMs-1和TAMs-2组合突变形式。 B．NNRTIs类耐药突变的演变规律为：最先出现的突变形式往往就是最终的优势种。4例患者包括四种不同的耐药突变演变途径： 一是G190A：治疗3个月时出现G190A突变，治疗18个月时发展为G190A，F227L突变组合，之后出现G190A，F227L，P236V三位点突变。 二是Y188C：治疗3个月时即出现Y188C突变并持续至随访结束。 三是V179D，Y181C：治疗3个月时即出现V179D，Y181C突变，随访结束时演变为V179D，Y181C，P236V。 四是治疗24个月前为野生型，治疗后期出现以K103N,M230L或K103N,Y181C为主要突变的耐药突变。 总之，在长期的抗病毒治疗过程中耐药突变的发生是一个渐变的过程，由简单而复杂。NNRTIs主要突变与NRTIs相比出现早，构成简单而持久。 第三部分HIV—1耐药性毒株的复制适应性(fitness)研究 为了在统一的基因背景下研究耐药突变对病毒复制适应性的影响，本研究首先利用对药物敏感的HIV-1传代株分别诱导3TC耐药株和NVP耐药株。将两耐药毒株分别与野生株在加药和不加药的环境中共同培养，连续培养4代，利用Taqman MGB探针通过实时定量RT-PCR技术检测每代培养物中耐药株和野生株RNA的相对比例，通过该比例随培养时间的变化趋势来评价耐药株和野生株的相对复制适应性。主要结果如下： A．在实验室分别用两种策略诱导成功我国第一株NRTIs耐药株(3TC耐药株)和第一株NNRTIs耐药株(NVP耐药株)。3TC耐药株半数抑制浓度(IC_(50))＞2mM，与野生株相比提高了11万倍以上；NVP耐药株IC_(50)＞1mM，与野生株相比提高了3万倍以上。 B．在加药的培养系统中，用等量的耐药株与野生株共同培养4代，从第1代到第4代，3TC耐药株RNA拷贝数占培养系统全部拷贝数的比例从76.2％增加至98.8％，而野生株则从23.8％下降至1.2％；NVP耐药株占培养系统全部拷贝数的比例从62.0％增加至90.5％，野生株则从38.0％下降至9.5％。表明在加药的培养系统中两种耐药株的复制适应性均高于野生株。 C．在不加药的培养系统中，用等量的耐药株与野生株共同培养4代，从第1代到第4代，3TC耐药株RNA拷贝数占培养系统全部拷贝数的比例从35.2％下降至5.3％，而野生株则从64.8％上升至94.7％，表明在加药的培养系统中，3TC耐药株的复制能力比野生株弱；NVP耐药株占培养系统全部拷贝数的比例从53.9％增加至75.0％，野生株则从46.1％下降至25.0％。表明在不加药的培养系统中NVP耐药株的复制能力比野生株强。 上述结果可以在一定程度上解释第一部分研究中NNRTIs耐药突变流行率较高且持久的现象。 第四部分我国HIV—1 B亚型流行株表型耐药性研究 表型耐药性检测方法是利用体外药敏分析方法对HIV—1耐药性进行的直接评价。我国目前对HIV-1耐药性的研究普遍采用的是基因型耐药性检测方法，从未对HIV—1临床分离株的表型耐药性进行过研究，也未对基因型耐药性检测结果与表型检测结果的符合程度进行过专门研究。在本研究中，我们选择了8株HIV-1临床分离株，对其基因型和表型耐药性进行了检测。主要结果如下： A．经过表型耐药性检测，待测毒株对AZT的IC_(50)在0.0006～0.1300μmol/l之间，与敏感株相比，IC_(50)的倍数变化在0.1～26.0之间；待测毒株对3TC的IC_(50)在0.0016～0.0390μmol/l之间，与敏感株相比，IC_(50)的倍数变化在0.5～11.5之间；待测毒株对NVP的IC_(50)在0.0104～0.4234μmol/l之间，与敏感株相比，IC_(50)的倍数变化在2.3～94.1之间；待测毒株对IDV的IC_(50)在0.0163～0.1142μmol/l之间，与敏感株相比，IC_(50)的倍数变化在0.8～5.4之间。表明我国部分HIV—1临床分离株已经对核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂产生了耐药性，部分毒株还显示出较高的表型耐药性。 B．基因型和表型耐药性检测的结果符合程度较高，可以用基因型检测方法代替表型对我国HIV—1流行株进行耐药性预测。