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B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影响的研究

陈良恩  
【摘要】: 本研究旨在观察慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者外周血mDCs和T淋巴细胞B7-H1(B7-homolog 1)及其受体PD-1(programmed death 1)的表达变化特点以及与患者疾病状态的关系;研究CHB患者mDCs和T淋巴细胞上B7-H1/PD-1表达变化对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)特异性T淋巴细胞功能的影响,阐明HBV慢性感染T细胞免疫功能下降的分子机制;探讨接受干扰素治疗的CHB患者B7-H1的表达变化特点及其与患者疗效之间的关系。 我们收集临床CHB患者外周血标本35份、健康人和自身免疫性肝炎患者外周血标本各10份,应用流式细胞技术分析外周血中mDCs和T淋巴细胞上B7-H1/PD-1的表达水平。结果显示,CHB患者和自身免疫性肝炎患者mDCs和T淋巴细胞上B7-H1的表达水平都明显高于健康对照,T淋巴细胞上PD-1的表达水平也都高于健康对照;我们发现,细胞因子IFN-α和IFN-γ可以在体外刺激健康人外周血mDCs和T淋巴细胞上B7-H1的表达,而对PD-1的表达没有明显的促进作用;另外,HBcAg对B7-H1的表达几乎也没有影响。我们推测CHB患者和自身免疫性肝炎患者B7-H1表达水平的升高可能与炎症因子的作用有关。结合CHB患者的临床资料,我们发现患者B7-H1/PD-1表达水平与ALT水平及HBV DNA载量都呈明显的正相关,说明B7-H1/PD-1的表达水平与CHB患者的疾病状态有密切关系。 在此基础上,我们进一步研究了B7-H1/PD-1抑制途径增强对CHB患者细胞免疫功能的影响。MDC在呈递抗原和效应T细胞的调节方面发挥了关键作用,研究显示,CHB患者mDCs功能受损可能是HBV特异性T淋巴细胞免疫功能降低的重要原因。因此mDCs上B7-H1表达上调对T细胞功能的影响成为本研究的重点。我们用患者及健康人的mDCs与非自体健康人的CD4~+或CD8~+T细胞混合培养,采用[~3H]-TdR掺入法和ELISA法检测细胞的增殖和细胞培养上清中细胞因子的浓度,并观察阻断B7-H1抑制途径的效果。发现患者的mDCs刺激异源性CD4~+或CD8~+T细胞增殖的能力和分泌Ⅰ型细胞因子的能力比健康人的mDCs明显降低;而阻断mDCs和T细胞之间的B7-H1/PD-1途径可以恢复患者mDCs对T细胞的刺激能力。我们还发现阻断B7-H1/PD-1抑制途径,细胞培养上清中IL-12的浓度明显升高,而IL-10的浓度则明显降低,说明阻断B7-H1/PD-1抑制途径,增强了mDCs与T细胞之间的相互作用能力,免疫功能得到部分恢复。 我们进一步研究了B7-H1/PD-1途径对HBV特异性T淋巴细胞免疫功能的影响。我们用HBcAg负载的MoDCs和自体T淋巴细胞混合培养,检测HBV特异性T淋巴细胞增殖的能力和产生Ⅰ型细胞因子的能力,同时观察阻断B7-H1/PD-1抑制途径的效果。结果显示,阻断B7-H1/PD-1途径能够明显提高抗原特异性T细胞的增殖以及Ⅰ型细胞因子的产生;同时发现阻断B7-H1/PD-1抑制途径,细胞培养上清中IL-12浓度明显升高,而IL-10浓度明显降低。我们还采用Elispot及细胞内因子染色法进一步断定了B7-H1/PD-1途径对HBV特异性T淋巴细胞IFN-γ产生的影响。以上结果说明,CHB患者mDCs和T细胞上B7-H1/PD-1表达水平升高是CHB患者病毒特异性T细胞免疫功能降低的一个重要因素。 鉴于CHB患者T淋巴细胞上B7-H1和PD-1表达水平都有明显升高,我们初步探讨了T细胞之间的B7-H1/PD-1途径对T细胞功能的影响。我们用CFSE标记检测T细胞增殖,发现阻断T细胞之间的B7-H1/PD-1途径可以提高患者T细胞的非特异性和特异性增殖,并且细胞内因子染色发现抗原特异性T细胞IFN-γ的产生也明显增多。说明CHB患者T细胞之间的B7-H1/PD-1抑制途径也能够影响T细胞的效应功能。 最后我们对干扰素治疗的CHB患者mDCs和T细胞上B7-H1的表达特点进行了动态观察,并分析了B7-H1的表达与干扰素治疗效果的关系。发现患者接受干扰素治疗后,B7-H1的表达会出现升高,但随着治疗时间的延长,干扰素治疗反应者B7-H1的表达水平下降,而治疗无反应者B7-H1一直持续高水平表达。我们比较了治疗反应者和无反应者治疗前和治疗24周后HBV特异性T细胞产生IFN-γ的能力,发现治疗反应者HBV特异性T细胞IFN-γ的产生频数治疗后比治疗前明显增多,而治疗无反应者则明显降低;阻断治疗反应者及无反应者细胞间的B7-H1/PD-1抑制途径,HBV特异性T细胞IFN-γ的产生频数均明显升高。因此干扰素治疗慢性乙肝B7-H1表达水平的升高可能会影响干扰素的治疗效果。 总之,CHB患者B7-H1及PD-1表达水平的升高可能是介导HBV特异性T细胞功能降低的重要原因,而阻断B7-H1/PD-1抑制途径可以增强HBV特异性T细胞的免疫功能;B7-H1表达水平的升高可能会影响干扰素对慢性乙肝的治疗效果。研究结果对于阐明慢性乙肝病毒特异性T细胞耐受的机制以及指导慢性乙肝的临床免疫治疗具有重要意义。


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