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肉毒毒素与蛋白受体相互作用的分子基础及其应用的研究

史晶  
【摘要】: 肉毒毒素(Clostridium botulinum neurotoxin,BoNT)通过与靶细胞表面受体特异结合,在受体介导的胞吞作用下内化进入细胞发挥强神经毒性作用。其中,肉毒毒素受体结合区与其靶细胞表面受体的特异结合是决定毒素分子毒性发生的关键起始步骤。研究表明,肉毒毒素Hc片段是其受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD),SynaptotagminsⅡ(sytⅡ)是新近研究发现的肉毒素素特异蛋白受体。目前对肉毒毒素与其受体相互作用的分子基础还缺乏足够的了解,寻找和鉴定在肉毒毒素与蛋白受体相互作用中发挥关键作用的结构基序将有助于揭示肉毒毒素的分子致病机制,为肉毒毒素的特异性防治研究提供新的思路。本论文针对肉毒毒素与靶细胞相互作用的关键环节,主要进行了三部分研究。 具体研究结果如下: 一、肉毒毒素受体结合区的主要抗原表位的研究 针对肉毒毒素受体结合区,采用生物信息学对其抗原表位进行综合分析及预测,并通过计算机模拟技术设计合成模拟表位肽,对其免疫学效应进行评价,同时利用噬菌体展示技术筛选针对模拟表位肽的特异结合短肽,评价噬菌体展示肽封闭特定抗原表位的毒素毒性中和能力,结果发现A、B型肉毒毒素受体结合区抗原表位的分布存在血清型的差异性,A型肉毒毒素受体结合区抗原表位分布较为宽泛,存在分散的多个优势抗原表位,主要位于片段1110-1172及1260-1295,实验结果还显示不同表位间存在协同保护作用;而B型肉毒毒素抗原表位的分布更为集中,主要位于受体结合区末端约四分之一的区域(1183-1291)。抗原表位的确定为肉毒毒素的防治提供明确的药物靶标,同时表位的分布特征也为不同血清型肉毒毒素抗毒素的研究策略提供了实验依据。 二、肉毒毒素与特异蛋白受体sytⅡ相互作用结合位点的鉴定 针对新近发现的肉毒毒素蛋白受体sytⅡ,首先进行重组制备获得可溶性受体sytⅡ-LD,分析其与不同血清型肉毒毒素及其Hc片段的结合活性,结果显示,可溶性受体可与B型肉毒毒素及其Hc片段特异结合,而与其他血清型没有结合,表明可溶性受体与B型肉毒毒素Hc片段的结合是特异的。应用Biacore SPR技术对可溶性受体与重组BHc蛋白的特异结合活性进行动态分析,测定亲和力为2.99×10~(-7)M。进一步对可溶性受体与B型肉毒毒素优势模拟表位肽的相互作用进行分析,结果发现,重组功能受体能与P7、P8模拟表位肽特异结合,提示它们可能共同构成毒素的受体结合位点(1235-1291)。同时根据SytⅡ氨基端泡内区氨基酸序列,化学合成了两段重叠受体肽,通过与肉毒毒素重组BHc的特异识别结合,初步确定SytⅡ-LD的毒素特异结合域为G37-K50。 三、功能蛋白受体的肉毒毒素毒性拮抗效应研究 应用肉毒毒素敏感细胞及小鼠模型,分析肉毒毒素特异蛋白受体的毒素拮抗效应,免疫荧光结果显示,可溶性受体sytⅡ-LD能与细胞膜受体竞争结合肉毒毒素,减少结合到SytⅡ~+ PC12细胞上的毒素。动物保护实验结果显示,可溶性受体sytⅡ-LD融合蛋白具有剂量依赖的毒素抑制作用,浓度达到270μg/mL时,小鼠存活率为25%。双受体是否存在协同作用?结果显示,单独使用神经节苷脂未发现明显的保护作用,但可以显著增强蛋白受体SytⅡ-LD与毒素的相互作用,提高蛋白受体SytⅡ-LD的毒素拮抗效应,同样剂量条件下小鼠存活率达到60%;在此基础上,利用linker序列将肉毒毒素受体片段与抗B型肉毒毒素ScFv连接,构建ScFv-SytⅡ-LD双功能分子,所构建的双功能分子能够明显抑制毒素毒性,其抑制活性比单独可溶性受体sytⅡ-LD有明显提高,双功能活性增强了母本可溶性受体或抗体的毒素特异靶向性,提高毒素毒性拮抗效应,有效延长了小鼠发病和死亡的时间。 以上研究为进一步加深对肉毒毒素受体结合区分子结构的认识,探讨肉毒毒素与宿主细胞受体相互作用的分子致病机制奠定了良好的基础,同时为肉毒毒素的特异性防治研究提供了新的思路以及作用明确的药物靶标。


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