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乙肝纤维化分期相关血浆标志物的定量蛋白质组研究

李树龙  
【摘要】: 肝纤维化发生的病因很多,我国多由HBV病毒感染导致,而在欧美等国则以酒精所致者多见。据世界卫生组织报道,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年大约有100万人死于HBV感染导致的肝衰竭、肝硬化以及肝癌。我国是病毒性肝炎高发区,仅乙型肝炎病毒(HBV)携带者就达1.2亿,其中慢性乙型肝炎患者有3,000万以上,约25%慢性乙肝患者最终将发展为肝硬化(Liver/hepatic cirrhosis,LC),甚至肝癌。假如肝纤维化病人得不到及时有效地治疗,就有可能逐渐转变为肝硬化,甚至进一步发展为肝癌,每年肝硬化患者中肝癌的发生率大约为3%~10%。肝纤维化既是一种代偿修复反应,又是肝损伤的促进因素,表现为肝内结缔组织过度增生与沉积。肝纤维化是一个慢性渐进的过程,准确诊断肝纤维化进程,可为病情诊断和临床治疗提供帮助。目前,肝穿刺活检病理检查是诊断慢性肝病肝纤维化、肝硬化的金标准,但其具有创伤性,患者易产生不适感及潜在并发症;病人不愿意接受多次肝穿跟踪监控病情及疗效等,所以常规肝穿刺活检在实际操作中具有相当难度。理想的诊断指标应具有高度敏感度和特异度,且简便易行,患者易于接受,故寻求无创性诊断肝纤维化的有效方法目前是临床医生关注的热点问题之一。 由于人体血浆(血清)包含了几乎涉及人体所有器官或者组织相关的丰富信息,并能反映几乎所有疾病状态信息,再加上它具有取材方便快捷低创等特点,是最为理想的临床治疗和诊断的样本材料。截至目前,在血浆中已经发现了与肝纤维化以及硬化相关的一些蛋白标志物,但由于它们在灵敏性和特异性等方面,还不能满足临床的需要,仍需借助肝穿进行病理检查。因此,还需要进一步发掘具有临床诊断或者治疗意义的血浆蛋白标志物。近年来,随着定量蛋白质组学技术的发展,整体系统地从蛋白质组水平分析血浆中与疾病及生理相关的蛋白标志物成为现实。 本实验以目前的肝纤维化分期检测“黄金标准”-肝穿病理检测结果为标准,利用定量蛋白质组技术手段,从血浆中挖掘与病理检测结果相一致的蛋白(群),以期发现与肝纤维化分期相关的新蛋白(蛋白组合),提高肝纤维化分期检测的精确性和灵敏度,服务于纤维化发生机制研究和临床实践。 乙酰化定量标记技术是针对肽段N末端进行氘(氢)标记的定量蛋白质组技术手段,具有标记完全、定量准确、操作简单、价格便宜等特点。本研究利用此技术,针对基于病理检查的乙肝纤维化一期(S1)、二期(S2)、三期(S3)、四期(S4)以及健康对照(S0)五组血浆样本(各组包含10例左右样本)进行差异对比分析,最终共得到了有定量信息的血浆蛋白1,063个,其中在肝脏纤维化不同时期具有显著差异(Ratio>1.5,P<0.05)的血浆蛋白246个,形成了与肝纤维化分级相关的候选蛋白(群)。针对差异蛋白定量Ratio值(组内蛋白与内标比值)进行聚类分析的结果显示,总体差异蛋白(群)被聚为五大类别,在五组样本(S0-S4)间分别呈现逐渐上升、逐渐下降、先上升后下降、先下降后上升以及上升下降波动等趋势。五组间的聚类结果显示,无纤维化以及纤维化前期(S0,S1,S2)被聚为一类,纤维化后期(S3,S4)被聚为一类,提示差异蛋白Ratio值在纤维化前后和后期呈现明显区别。其聚类分布特点与纤维化发展进程与实际病理特点相吻合。利用基于文献数据支持的Ingenituy通路分析软件对246个差异蛋白进行分析,结果表明,这些鉴定的差异蛋白大部分被定位在了八个主要的信号通路网络(血管系统发育网络图/脂类代谢网络图/细胞生长分化通路网络/免疫及淋巴系统调控网络/细胞信号传导与组织发育网络/氨基酸代谢与蛋白修饰网络/转录调控网络/细胞分裂网络),它们又交叉状形成一个整体相互作用网络图。部分蛋白的western验证结果表明,质谱定量信息是准确的,而且,初步的验证结果也显示,a1酸性蛋白、纤维结合蛋白、细胞分裂周期蛋白23等在纤维化分期诊断方面,具有很好的标志信息,具有进一步扩大样本群深入挖掘的潜力。


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