重组VEGF可溶性受体的构建表达与鉴定

【摘要】： 恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康的一类疾病。血管对于肿瘤生长起着重要作用。近年来,抗血管生成疗法治疗恶性肿瘤受到广泛关注,取得了令人瞩目的 成果。在发现的一系列调控血管生成的因子中,血管内皮生长因子(VEGF)是其中作用最强的一个。目前发现VEGF家族有6个成员:VEGF、PIGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。VEGFR家族有5个成员,其中主要的3种是VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)。其中VEGFR-1是VEGF的高亲和力受体,对血管生成主要起调节作用,VEGFR1和VEGF结合的关键部位是第2、3结构域(R1D2-3);VEGFR-2是引起内皮细胞增殖转移的最主要受体,VEGF促进瘤细胞生长、侵袭和转移的作用也是通过VEGF与瘤细胞上的KDR结合,调控下游基因的表达而实现的,VEGFR2和VEGF结合的关键部位是第3结构域(R2D3),第2、4结构域对于高亲和力的结合起重要的作用;VEGFR-3主要调节淋巴内皮细胞的增殖、移行、存活和淋巴管的生成,促进肿瘤淋巴转移,VEGFR3和VEGF-C结合的关键部位是第1、2结构域(R3D1-2)。 既然VEGF受体与VEGF有极高的亲和力,因此,可溶性VEGF受体与VEGF结合的能力可能会强于抗VEGF抗体,从而起到更好的中和作用。VEGF Trap 12 (取用了VEGFR-1、VEGFR-2与VEGF结合的最关键结构域,组合成一个新的“超级”受体)的实验数据已说明了这一点。我们在此基础上,将VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3与其配体结合的关键结构域进一步进行组合,以期找到能够更好中和VEGF/VEGF-C的诱捕性、可溶性受体。 该课题采取的实验方法及取得的结果主要是: 1.获得了VEGF及其受体基因,构建了相应真核表达载体。 1)通过RT-PCR以及人工合成,得到了VEGF121、VEGF165、VEGF-C以及VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3胞外区基因; 2)构建成功VEGF121-pCDNA3.1、VEGF165-pCDNA3.1、VEGF-C-pIRES2 -EGFP真核表达载体; 3)构建成功VEGFR-1/Fc-pCDNA3.1、VEGFR-2/Fc-pCDNA3.1、VEGFR-3/Fc-pCDNA3.1、VEGF Trap 12-pCDNA3.1、VEGF Trap1C-pIRES、VEGF Trap3C-pIRES、VEGF Trap1H-pIRES、VEGF Trap1H-pBudCE4.1、VEGF Trap3H-pIRES,VEGF Trap3H-pBudCE4.1真核表达载体。 2.在CHO-K1细胞中表达了VEGF trap蛋白,挑选出表达水平较高、生长状态较好的单克隆细胞株,共获得了11种重组蛋白的稳定表达细胞系,无血清培养并收获上清,纯化了表达产物,并用SDS-PAGE、Western Blot分析了蛋白纯度、分子量等特性,通过质谱鉴定进一步确定了蛋白种类。 1) VEGF121、VEGF165、VEGFR-1/Fc、VEGFR-2/Fc、VEGFR-3/Fc、VEGF Trap12获得了具有表达水平2-5μg/106cell·24h的细胞株,VEGF Trap1C、VEGF Trap1H、VEGF Trap3H获得了具有表达水平50-280 ng/106cell·24h的细胞株,VEGF-C、VEGF Trap3C仅获得了具有表达水平1-5 ng/106cell·24h(估计值,仅在ELISA水平可检测)的细胞株,不能获得足量蛋白,因此无法进一步分析。 2) VEGF121的非还原型电泳样品形成四条带,相对分子量分别为27,32,36.5,40kD,还原型电泳样品呈三条肽链,相对分子量分别约为20,15,12 kD;VEGF165的非还原型电泳样品形成二条带,相对分子量分别为38,44kD,还原型电泳样品同样呈三条肽链,相对分子量分别约为25,20,15kD; VEGFR1/Fc单体(还原电泳)分子量81kD,二聚体(非还原电泳)分子量162kD,纯度91%;VEGFR2/Fc单体(还原电泳)分子量96kD,二聚体(非还原电泳)分子量174kD,纯度96%;VEGFR3/Fc单体(还原电泳)分子量107kD,二聚体(非还原电泳)分子量190kD,纯度93%;VEGF trap12单体(还原电泳)分子量68kD,二聚体(非还原电泳)分子量143kD,纯度87%;VEGF trap1C单体(还原电泳)为一条带,分子量64kD,二聚体(非还原电泳)分子量124kD,分子结构与设计不一致;VEGF trap1H、VEGF trap3H分子结构与设计不一致。 3) VEGF121、VEGF165、VEGFR-1/Fc、VEGFR-2/Fc、VEGF Trap12经LC-MS/MS测序分析,均以较高的分数与相应蛋白匹配,且序列覆盖率达到了30-60%左右。 3.运用SPR测定了部分VEGF trap的亲和常数,运用人微静脉内皮细胞检测了各蛋白对于内皮细胞增殖、迁移、管腔形成的影响,在鸡胚绒毛尿囊膜上检测了各分子对于鸡胚血管生成的影响,采用Directed In Vivo Angiogenesis Assay (DIVAA?)检测试剂盒,检测了各蛋白在裸鼠体内对血管生成的影响。评价了VEGF trap12对于裸鼠体内移植瘤的影响。 1)我们确认了VEGF trap、VEGFR1/Fc、VEGF trap1C与VEGF有较高的亲合力,KD值分别达到了382pM,265pM和591pM;而VEGF trap 1H与VEGF亲合力过低,没有进一步研究的价值。ELISA实验显示,VEGFR3/Fc与VEGF-C的亲和力高于VEGF trap 3H。 2)细胞实验表明,VEGF trap 12、VEGFR1/Fc在200ng/ml以上、VEGFR2/Fc在2000ng/ml以上对于内皮细胞的增殖有明显的抑制效应;VEGFR1/Fc和VEGF trap12在50ng/ml即显著抑制细胞迁移,在800ng/ml抑制效应趋于饱和;VEGFR2/Fc在500ng/ml也能显著抑制细胞迁移,但在8000ng/ml对细胞的抑制效应仍不及前两者在800ng/ml抑制效应;三种VEGF trap分子对于HMEC-1管腔形成无明显抑制。 3)三种VEGF trap分子对于鸡胚绒毛尿囊膜血管生成均有较明显的抑制作用。VEGFR1/Fc和VEGF trap12在5pM即显著抑制CAM血管生成,在5pM-25pM抑制效应呈明显的量效依赖关系;VEGFR2/Fc在10pM即显著抑制CAM血管生成,在10pM-50pM抑制效应呈明显的量效依赖关系,但在50pM对细胞的抑制效应仍不及前两者在10pM的抑制效应。 4)三种VEGF trap分子对于裸鼠体内血管生成均有较明显的抑制作用。VEGFR1/Fc和VEGF trap12在10-10M即部分抑制裸鼠体内血管生成,在10-7M基本完全抑制裸鼠体内血管生成,在10-10M-10-7M抑制效应呈明显的量效依赖关系;VEGFR2/Fc在10-9M即显著抑制CAM血管生成,在10-6M基本完全抑制裸鼠体内血管生成,在10-9M-10-6M抑制效应呈明显的量效依赖关系。 5) VEGF trap12在10mg/kg能够明显抑制裸鼠体内HepG2细胞的生长与转移。 通过以上研究,本课题共表达获得了3种VEGF分子,8种VEGF trap分子,构建了它们的稳定表达细胞系,并纯化获得了蛋白,鉴定了分子质量、纯度与种类;首次运用SPR方法准确测定了VEGFR1D1-3及VEGF trap12与VEGF165的亲和常数,证明前者的亲和力不低于后者;在细胞水平、胚胎水平和成熟小鼠体内对三种亲和力较高的VEGF trap分子体内外抑制血管生成的活性进行了充分验证,证明三者均具有良好的抑制血管生成的活性。运用裸鼠皮下移植瘤模型证明VEGF trap12能够有效抑制HepG2肿瘤细胞的生长和转移。