分枝杆菌噬菌体D29气溶胶特性和动物气溶胶暴露系统的初步研究

【摘要】： 面对全球严峻的结核病耐药状况,到目前为止,还没有理想的新型抗结核药物进入临床应用,人类急需发现新的药物作用靶点、新的药物筛选模型以致最终完成新型的抗结核药物研制。分枝杆菌噬菌体具有裂解结核分枝杆菌的作用,具有治疗结核病的潜在价值,能否成为一个抗结核病的新药,也倍受关注。结核病最常见的感染脏器为肺脏,目前已有的噬菌体治疗结核分枝杆菌研究的给药方式为皮下注射、滴鼻途径,噬菌体到达肺脏的有效剂量低,如果采用气溶胶吸入给药途径,可能效果会更好,分枝杆菌噬菌体气溶胶吸入治疗结核分枝杆菌是一个值得深入研究的领域。 噬菌体D29气溶胶的粒子大小、粒径分布以及耐雾化能力是其能否使用气溶胶吸入给药治疗的关键。DV40发生器不同介质发生的气溶胶动力学直径为0.8微米左右。TSI3321测试的噬菌体D29气溶胶总粒子空气动力学直径为0.872微米,Anderson六级采样器采集的生物粒子气溶胶的质量中值直径为2.21微米,噬菌体D29在喷雾流量10L/min,压力1.8kg/cm2,发生液介质为PBS磷酸盐缓冲液的条件下雾化30分钟存活率为48.86%、雾化60分钟存活率为30.12%,具有较强的耐雾化能力。每分钟的喷雾量为232μl。在此条件下产生的气溶胶生物粒子的质量中值直径为2.21微米,可以进入肺脏,在此条件下发生的气溶胶可以满足动物气溶胶吸入研究的要求。AGI-10液体冲击式采样器加入消泡剂橄榄油后可以提高噬菌体D29的耐冲击能力,但噬菌体D29的绝对数量比不加的要少,因此AGI-10液体冲击式采样器采样时不加消泡剂橄榄油。 传统的结核分枝杆菌噬菌体D29的定量检测方法为双层琼脂培养法,从宿主菌的培养到双层琼脂培养计数,即使使用快速生长耻垢分枝杆菌作为宿主菌,整个过程也要4-5天,快速检测方法对于噬菌体D29气溶胶治疗结核分枝杆菌的相关研究具有重要意义。SYBR greenⅠ荧光染料方法简便易行、价格便宜。Ct值(Y)和对数浓度lgN(X)的直线方程为:Y=-3.08X+37.46,误差为0.026,相关系数为-0.996。本研究中气溶胶样本QPCR的检测结果是双层琼脂计数法的78.19倍,QPCR检测结果明显高于培养法的结果。而在噬菌体D29新鲜的液体样本中QPCR法和培养法的符合性较好。检测的灵敏度为10~1PFU/反应。QPCR方法可以大大提高定量速度,从采集样本到得到检测结果只要3-4小时。 气溶胶吸入治疗、免疫及药效评价的实验室研究离不开动物气溶胶暴露技术平台,该技术平台是上述研究工作的基础。呼吸道气溶胶吸入是病原微生物感染的重要途径,气溶胶吸入病原微生物往往产生不同于传统感染途径的病症,病情严重,且传统疫苗对吸入感染的保护效果较差。研制新型有效的疫苗和治疗药物需要病原微生物气溶胶攻毒感染途径,建立病原微生物气溶胶感染动物模型。目前市场上只有动物全身暴露气溶胶系统,由于全身暴露的种种缺陷,研究人员更多的使用动物口鼻气溶胶暴露系统。由于动物口鼻暴露系统的工艺较复杂,且属于多学科交叉,目前各研究单位如:美国陆军传染病研究所使用的全自动生物气溶胶暴露系统全部为自制。为了建立动物气溶胶暴露技术平台,满足动物气溶胶感染、暴露动物实验的需要。建立了由洁净压缩空气系统、气溶胶发生系统、补气系统、气溶胶采样分析系统、动物暴露装置、污染气流净化系统等组成的动物口鼻气溶胶暴露技术平台。 对建立的动物气溶胶暴露系统,进行了所有气溶胶粒子和生物气溶胶粒子分布是否均匀的评价。使用粘质沙雷氏菌8039和噬菌体D29气溶胶,TSI3321气溶胶测试仪测试了所有粒子分布情况,微生物采样器检测生物粒子气溶胶的分布情况,无论生物粒子气溶胶还是所有粒子气溶胶的采样结果表明暴露装置上下层和每层各暴露口之间气溶胶浓度差异不显著。对各种微生物气溶胶浓度的采样方法进行了研究,发生高浓度微生物气溶胶时,由于浓度过高,超出了Anderson六级采样器的定量限度,应使用AGI-10液体冲击式采样器;发生中浓度气溶胶,Anderson六级空气微生物采样器的采样结果显著高于AGI-10液体冲击式采样器,应使用Anderson六级空气微生物采样器。由于AGI-10液体冲击式采样器的采样流量只有7升/min,发生低浓度气溶胶时,采样时间过长会对微生物具有较大损伤,AGI-10不适用于低浓度微生物气溶胶采样,应使用Anderson六级空气微生物采样器进行采样检测。发生高浓度粘质沙雷氏菌8039和噬菌体D29气溶胶时,在暴露装置的周围放置沉降平板,沉降平板未见相应微生物的生长,结果表明在使用高浓度模拟微生物进行气溶胶评价时未发生气溶胶泄露。 本研究对噬菌体D29气溶胶的特性参数进行了研究,并建立了噬菌体D29气溶胶的QPCR检测方法。建立了动物口鼻气溶胶暴露技术平台,模拟细菌、病毒气溶胶分布均匀,各暴露口浓度差异不显著。高浓度气溶胶暴露时模拟微生物气溶胶未发生泄露。对各种浓度的微生物气溶胶采样方法进行了研究,为下一步噬菌体D29气溶胶吸入治疗的动物实验奠定了基础。