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红霉素抑制成神经细胞瘤增殖机制的初步研究

贾勇圣  
【摘要】: 红霉素(Erythromycin, EM)是由红色链丝菌培养液中分离出来的一种抗生素,作为大环内酯类抗生素,其对革兰氏阳性球菌及致非典型肺炎病原体的抗菌作用使其成为对青霉素过敏病人上、下呼吸道及软组织感染治疗的适宜药物。Herg(human ether-a-go-go related gene)基因编码的钾离子通道被习惯称为HERG钾通道。近年来研究报道,红霉素可以浓度依赖性地抑制HERG钾电流,对于HERG钾通道高表达的肿瘤细胞系,红霉素可抑制其增殖。研究证明:HERG钾通道在许多肿瘤细胞系表达显著上调,参与肿瘤细胞增殖、分化和凋亡的信号转导过程,还与肿瘤侵袭转移、血管形成以及化疗敏感性等密切相关。我们以前的研究工作证实在细胞和动物水平通过RNA干扰HERG钾通道表达,可以抑制人成神经细胞瘤的增殖。但是到目前为止,红霉素抑制肿瘤细胞增殖的具体机理仍不清楚。因此本实验选择了HERG蛋白高表达的人成神经细胞瘤系SH-SY5Y细胞作为研究对象,在分子和细胞水平上探索红霉素抑制成神经细胞瘤增殖的作用机制,主要集中在以下两个方面。 1.红霉素对SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、自噬以及细胞周期调控的影响; 2.红霉素对癌蛋白和抑癌蛋白的表达调节作用。 研究方法 本研究采用细胞计数和四唑盐(MTT)法来检测红霉素对细胞增殖速度和存活率的影响。通过相差显微镜观察红霉素处理后SH-SY5Y细胞的形态学变化。对细胞进行碘化丙啶染色,利用流式细胞仪检测细胞内DNA含量,评价红霉素对细胞周期分布的影响。红霉素对SH-SY5Y细胞的凋亡诱导作用通过两种方法测定:应用流式细胞仪分析细胞DNA亚二倍体凋亡峰及使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒定量分析磷脂酰丝氨酸外翻。通过分析微管相关蛋白1轻链3B(LC3-Ⅱ)的表达来确定红霉素对SH-SY5Y细胞的自噬诱导作用,方法为荧光显微镜观察和流式细胞仪检测LC3细胞免疫荧光染色以及Western blotting分析LC3-Ⅱ表达。采用Ca2+敏感的探针Fluo-3AM进行标记,流式细胞术检测红霉素长期作用后对细胞内钙离子浓度的影响。Western blotting分析红霉素对SH-SY5Y细胞中癌蛋白c-Myc和抑癌蛋白p21(WAF1/Cip1)表达的影响。RT-PCR用来检测herg和c-myc基因的表达变化。关于红霉素对癌蛋白c-Myc的作用通路,采用siRNA干扰HERG钾离子通道表达,由此来验证红霉素是否是通过阻滞HERG钾通道来发挥对c-Myc的表达调节作用。 研究结果 1.红霉素能够浓度和时间依赖性地抑制SH-SY5Y细胞增殖,62.5、125、250、500μM红霉素给药72 h对SH-SY5Y细胞增殖抑制率分别为13.50%、24.75%、37.25%、90.75%,呈现浓度依赖关系;250μM红霉素给药24 h、48 h、72 h、96h,SH-SY5Y细胞增殖抑制率分别为4%、26%、37%、53%,呈现时间依赖关系。 2. MTT实验显示,红霉素能够浓度和时间依赖性地抑制SH-SY5Y细胞活力水平。500μM红霉素给药24 h、48 h、72 h,细胞存活率分别为:77.28±0.01%、59.71±0.02%、44.27±0.01%。红霉素作用24 h、48 h、72 h的IC50分别为205.01μM、187.29μM、187.97μM。 3.细胞周期分析结果显示,红霉素能够使SH-SY5Y细胞发生S期阻滞,且这一效应具有时间依赖性。500μM红霉素作用24 h、48 h、72 h,S期比例分别为3.5±1.56%、6.12±0.26%、14.95±1.63%。与溶剂对照组3.66±0.49%、5.66±0.11%、7.05±1.02%相比具有显著统计学差异。 4.红霉素孵育48 h和72 h,部分SH-SY5Y细胞开始变圆,贴壁能力降低,表现出凋亡特征,即细胞膜出现发泡现象。应用红霉素处理细胞到72 h,含有DNA亚二倍体的细胞比例明显增多,500μM红霉素孵育24 h、48 h、72 h,SH-SY5Y细胞凋亡百分率从0 h的0.02±0.01%分别提高到0.04±0.05%、0.81±0.03%和21.57±1.22%。随着孵育时间延长,红霉素诱导SH-SY5Y细胞凋亡的百分率逐渐增高。 5. SH-SY5Y细胞进行Annexin V-FITC/PI双染后,流式细胞仪分析显示,500μM红霉素处理细胞24 h、48 h、72 h,细胞总凋亡率分别是:2.81±0.43%、5.3±0.04%、10.10±0.40%。 6. 500μM红霉素处理SH-SY5Y细胞72 h,细胞内Ca2+浓度药物组比溶剂对照组升高2.04倍。 7. 500μM红霉素作用72 h,Western blotting结果显示蛋白表达量比值LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ,药物组是溶剂对照组的6倍,说明给药组中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,SH-SY5Y细胞发生自噬。 8. 62.5-500μM红霉素作用72 h,c-Myc表达量随红霉素浓度增高而逐渐降低,呈现浓度依赖关系。500μM红霉素处理细胞24 h、48 h、72 h,随药物作用时间延长,c-Myc表达量逐渐降低,呈现时间依赖关系。 9.正常SH-SY5Y细胞p21(WAF1/Cip1)不表达,对照溶剂组也未检测到p21(WAF1/Cip1)表达,62.5-500μM红霉素作用48 h,随红霉素浓度增加,p21(WAF1/Cip1)表达逐渐上调,呈现浓度依赖关系。10. siRNA干扰HERG钾通道表达后,c-Myc基因mRNA和蛋白量表达均降低。 结论 本实验研究证实红霉素能够浓度和时间依赖性地抑制SH-SY5Y细胞增殖;红霉素能够使SH-SY5Y细胞发生S期阻滞,可能与癌蛋白c-Myc表达下调有关。红霉素能够诱导细胞凋亡,主要因素包括:抑癌蛋白p21(WAF1/Cip1)表达上调,细胞内钙离子超载。红霉素对c-Myc表达抑制作用可能与阻滞HERG钾通道有关。另外红霉素还可以诱导SH-SY5Y细胞发生自噬。总之,根据本实验的研究结果可以推测,红霉素作为一种可以口服的药物,对于人成神经细胞瘤的治疗具有潜在的应用价值。


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