规模化磷酸肽富集技术和策略研究及其应用

【摘要】： 磷酸化修饰是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是真核细胞生命活动最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程,调控着包括信号转换、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。因此,对蛋白质磷酸化修饰的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对磷酸化蛋白质的检测和磷酸化位点的确定是认识蛋白质磷酸化在生命活动中调控机制的重要参考信息,用蛋白质组学的策略研究生物体的磷酸化修饰也是功能蛋白质组学的重要研究内容。由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低,对它的检测和位点分析一直是个艰难的工作,而磷酸化蛋白质的规模化分析和位点鉴定更是磷酸化蛋白质组研究面临的技术挑战。从肽段水平进行磷酸肽的富集,可以提高磷酸肽在复杂样本中的丰度,增加质谱对磷酸肽的检测效率,并提供明确可靠的位点信息。因此,对磷酸肽富集的研究,是磷酸化蛋白质组学研究的热点和难点之一。本论文在规模化磷酸肽富集技术和策略方面展开研究,建立了高效的二氧化钛富集磷酸肽新型技术体系,有效的提高了材料对磷酸肽的富集效果;同时建立了使用联用富集技术的规模化磷酸肽富集策略,并将此策略应用于鼠肝线粒体磷酸化蛋白质组的研究,为获得更大规模,更全面的磷酸化数据奠定了基础。 在论文的第一部分以牛α酪蛋白酶切肽段为样本,对二氧化钛富集磷酸肽的方法进行了考察,从上样溶液中有机溶液浓度,不同酸种类及酸浓度,离子强度和加入竞争抑制剂等方面,对富集方法进行优化。同时首次使用天冬氨酸作为竞争抑制剂,提高了二氧化钛材料对磷酸肽的选择性,增加了非冗余磷酸肽的鉴定数量。在对以9种标准蛋白酶切肽段混合物为样本的富集实验中,取得了很好的效果。通过本研究,证明了二氧化钛材料富集磷酸肽的效果与样本复杂程度有关,在复杂样本中,富集效果下降。我们将此方法应用于微米与纳米两种粒径的二氧化钛富集磷酸肽实验,实验结果表明加入天冬氨酸可以提高这两种不同粒径材料的富集效果。但是由于富集原理不同,此方法用于IMAC材料富集磷酸肽对材料富集效果提高没有明显改善。 在本论文的第二部分,提出了SCX-TiO2与SCX-Fe3+-IMAN两种富集技术联用的策略,并应用于鼠肝线粒体磷酸化蛋白质组研究。使用SCX-TiO2技术路线鉴定到37个非冗余磷酸肽,包含69个磷酸化位点,属于37个磷酸化蛋白。使用SCX-Fe3+-IMAN技术路线,鉴定到44个非冗余磷酸肽,包含63个磷酸化位点,属于40个磷酸化蛋白。两种技术路线一共鉴定到77个非冗余磷酸肽,包含128个磷酸化位点,属于71个磷酸化蛋白。初步建立了小鼠肝脏线粒体磷酸化蛋白质数据库。