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EPR效应在实体瘤被动靶向性治疗中的应用探讨

梅梅  
【摘要】: 实体瘤组织血管系统与正常组织相比有很多不同。肿瘤直径达到2mm左右时,就诱导血管发生,形成新血管系统以满足不断增长的营养和氧需求,使血管密度增加。肿瘤血管形状构造不规则、血管壁膨胀缺失,血管内皮细胞排列不紧密、间隙大,文献报道人结肠腺癌血管孔径达400nm。正常组织中,血管平滑肌肉层在乙酰胆碱、NO等调节因子的作用下松弛或收缩以维持稳定的血流和血压;而肿瘤血管内皮细胞周围的平滑肌缺失使其丧失了自发调节功能而处于持久扩张状态,使血管渗漏增加。肿瘤血管内皮生长因子(VEGF/VPF)、缓激肽(BK)、NO、前列腺素(PGs)、基质金属蛋白酶(MMPs)等调节因子生成增多、交互作用加强,促使血管通透性增加。上述原因导致大分子物质可以透过血管壁进入肿瘤组织,在肿瘤组织滞留量增加;此外,肿瘤组织淋巴清除系统缺失,使需经淋巴系统清除的大分子药物和脂质等在肿瘤组织贮留时间延长,构成了大分子物质肿瘤被动靶向性的基础。 大分子药物包括脂质体不能透过血管进入正常组织,但在肿瘤组织蓄积量增加、贮留时间延长,这种现象被称为EPR效应(Enhanced Permeability and Retention)。实体瘤解剖学和病理生理学的改变是大分子化合物存在EPR效应的根本原因,有文献报道大分子在肿瘤组织滞留时间可以延长数周甚至数月。分子量大于40KDa(大于肾阈值)、血浆半衰期较长的大分子及大脂质体存在此效应。 伊文思蓝(Evans Blue,EB)是实验诊断用药,被广泛用作血浆和血容量测定及血脑屏障、毛细血管通透性的研究。它是一种水溶性染料,具有四个对称的磺酸基,能与蛋白表面亲核集团如赖氨酸、精氨酸或羟基发生磺化反应,与蛋白质间形成氨苯磺胺或磺酸酯链复合物。血浆白蛋白约占血浆总蛋白含量的60%,结构和立体构象赋予了它结合其他物质的能力,如结合正常的代谢产物长链脂肪酸、类固醇等和外来的非生物物质如药物和染料等。EB入血后迅速与白蛋白牢固结合,形成稳定的大分子复合物。文献报道伊文思蓝在血液中优先与白蛋白结合,当血浆中伊文思蓝与白蛋白摩尔比小于8时,伊文思蓝只与血浆白蛋白结合。本文采用合理的EB用量,以EB-白蛋白作为大分子模型,研究其在肿瘤组织的蓄积和滞留情况,观察到其在肿瘤组织内分布显著高于其它组织(P0.01)。肿瘤临床切除手术中,在切除大肿瘤后,微小肿瘤灶的切除是防止术后复发的重要措施,由于肉眼很难区分微小肿瘤灶与正常组织界限,所以经常有肿瘤切除不彻底的情况,使肿瘤存在复发的可能性。通过对EB-白蛋白复合物组织分布的研究,我们观察到肿瘤灶和肿瘤周围囊肿的EB着色显著高于正常组织,肉眼很容易区分,因此,我们尝试开发伊文思蓝作为肿瘤着色剂的新用途。 我们静脉注射伊文思蓝,EB-血浆白蛋白大分子通过EPR效应在肿瘤组织蓄积,伊文思蓝的生物染料性质使肿瘤组织着色,我们观察到EB甚至可以使1-2mm的小肿瘤着色,便于临床医生手术时分清肿瘤灶与正常组织的界限,协助手术切除完整顺利地进行,并为肿瘤相关基础实验研究提供技术支持。小鼠实验表明:EB作为肿瘤着色剂的最佳给药时间为术前2-5天,最佳给药剂量为0.1-0.2mg EB /10g体重。 我们知道伊文思蓝通过与血浆白蛋白牢固结合形成大分子化合物,通过EPR效应可以产生肿瘤被动靶向性。这提示我们药物与蛋白的键合在大分子自组装、EPR效应应用—增加化疗药靶向作用、提高疗效方面有重要的价值,因此我们尝试将常规小分子化疗药长春新碱与牛血清白蛋白(BSA)在体外通过弱键结合后给药,在药理学上观察探讨其对抗肿瘤作用的影响。 实验表明体外通过弱键与蛋白结合并没有增加长春新碱等常规小分子化疗药的药效,说明这些常规小分子自身与BSA的结合很弱,因此这种结合在体内被较快解离,药物游离型与结合型又形成了新的平衡,新形成的结合型药物仍不稳定,因此进入体内不能形成伊文思蓝-白蛋白那样比较稳定的大分子化合物,不能充分利用EPR效应提高肿瘤靶向作用。 LHRHR在众多恶性肿瘤细胞表面表达,对肿瘤细胞的生长、发展起负性调控的作用。本文受试药物LHRH-PE38(促黄体激素释放激素突变体-绿脓杆菌外毒素A突变体重组蛋白)是将与肿瘤特异性结合的LHRH作为导向分子与毒素蛋白突变体PE38连接,分子量大于40KDa,是一种大分子抗癌药。我们在LHRH- PE38抗肿瘤药效的基础上,通过与其裸药PE38药效的比较,对LHRH- PE38肿瘤靶向分布的机制进行初步了探讨。 体外实验表明,LHRH-PE38对表面大量表达LHRHR的BGC823、MCF-7、Lovo等肿瘤细胞有明显抑制作用,抑制率达到72.6-83.3%。当药物作用浓度较低、作用时间较短时,LHRH-PE38主要通过受体识别作用靶向杀伤肿瘤细胞;随着作用浓度增加、时间延长,受体识别的优势不再明显,细胞直接内吞药物起主导作用。 LHRH-PE38在体内可抑制多种移植瘤的生长,LHRH-PE38 (100μg?kg-1)抑制BGC823移植瘤的生长达到62.5%,LHRH-PE38 (100μg?kg-1)抑制MCF-7移植瘤的生长达到51.7%,LHRH-PE38 (100μg?kg-1)抑制Lovo移植瘤的生长达到34.7%。对Lovo移植瘤的生长抑制实验表明,LHRH-PE38(100μg?kg-1)抑制率为34.7%, PE38 (100μg? kg-1)抑制率为39.2%;LHRH-PE38(50μg?kg-1)抑制率为27.2%, PE38 (50μg? kg-1)抑制率为20.3%。初步说明LHRH-PE38主要利用大分子的特性,通过EPR效应实现肿瘤组织的选择性投放,完成药物代谢动力学中的分布相,进一步结合主动识别LHRHR的作用,实现肿瘤靶向杀伤作用。LHRH- PE38将受体识别的主动靶向作用与大分子肿瘤被动靶向EPR效应相协同发挥药效,并且后者在肿瘤靶向性分布的实现中发挥主导作用。 本文对EPR效应在实体瘤被动靶向性治疗中的应用进行了初步探讨,EPR效应为大分子化疗的提供了理论依据和实践基础,为减轻传统化疗的毒副作用提供了指导作用。


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