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S100A4蛋白对运动氧化应激致心血管内皮细胞凋亡的分子调控

王天辉  
【摘要】: 人体进行力竭运动时,会产生大量氧自由基,诱发心血管内皮细胞凋亡,导致心血管疾病的发生。而诱发心血管内皮细胞损伤的因素很多,其中氧化应激在心血管疾病的发生中起着重要作用。S100蛋白家族是一组结构与功能相似的低分子量钙结合蛋白,具有组织分布特异性。不同S100蛋白具有不同的生物学活性,其细胞内定位及表达模式不同,且可形成同源或异源二聚体,在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌及细胞凋亡中发挥着重要作用,其功能异常亦可导致不同的疾病。S100A4蛋白是S100家族成员之一,人们对它的研究主要集中在肿瘤学领域,其作为促肿瘤转移因子与肿瘤的发生、发展及预后相关。研究表明S100A4蛋白在心血管内皮中有表达,具有促血管生成作用。因此,我们推测S100A4蛋白对防止心血管系统损伤可能起到关键性的保护作用。近来研究表明,在肿瘤细胞增殖过程中,S100A4与P53蛋白的C末端区域结合,影响P53的亚细胞定位及转录活性,从而对细胞凋亡过程产生影响。但S100A4蛋白作为心脏损伤潜在的保护因子,在力竭运动氧化应激心血管内皮细胞凋亡中的调控机制尚不清楚。p53作为细胞凋亡的重要介导因子,S100A4蛋白可以与野生型p53蛋白的C末端的调控区结合,影响其功能。那么S100A4蛋白是否参与了心血管内皮细胞凋亡通路的调节?S100A4蛋白在p53蛋白凋亡途径中发挥作用的机制是什么?有待研究证实。那么在力竭运动氧化应激损伤的内皮细胞凋亡通路中,S100A4蛋白是否通过影响p53蛋白进出核及其转录活性,调控细胞凋亡?目前还未见报道。因此,本课题针对这些问题,通过建立大鼠力竭运动氧化应激心血管内皮细胞整体动物模型和体外培养心血管内皮细胞氧化应激损伤模型,观察S100A4蛋白在力竭运动损伤心血管内皮细胞中的表达变化规律;构建S100A4蛋白表达载体,表达并纯化S100A4蛋白。通过体外干预的方法,观察S100A4蛋白通过p53途径对氧化应激心血管内皮细胞凋亡的影响,初步阐明S100A4蛋白对心血管内皮细胞凋亡的调控机制,为研究心血管内皮损伤防护新措施及开发新制剂开辟新思路。主要研究结果如下: 一、S100A4和p53蛋白在力竭运动氧化应激大鼠心肌组织中的表达分布规律 Wistar大鼠12只,随机分为对照组(Control,CN)和力竭运动损伤组(Exhaustion exercise injury,EI),进行10天连续力竭训练;训练结束后,立刻采集血液和心肌组织样本。结果表明:力竭运动后,大鼠血液中LDH活性(72.13±3.68U/L,P0.01)显著高于对照组(18.50±2.98U/L),NO含量降低25.15%,而MDA含量升高1.90倍,同时SOD活性下降26.11%。结果表明,力竭运动导致机体损伤,尤其是心血管内皮细胞损伤,提示心血管损伤的主要因素之一是自由基增多造成的氧化应激损伤。HE染色结果揭示,对照组心肌组织结构完整,未见明显病变;力竭运动损伤组主要表现为心肌和血管内皮细胞空泡变性和心肌间质水肿等。在电镜下可见,血管内皮细胞发生线粒体肿胀变形、空泡化,细胞核浓集、边缘化以及凋亡小体出现的典型细胞凋亡特征。由血液生化及病理指标的变化综合判断可知,力竭运动不仅可致心血管氧化应激损伤,还可诱发大鼠心血管内皮细胞凋亡。Western-blot结果可见,CN组心肌组织中S100A4蛋白弱表达,EI组表达量升高;同时检测到野生型P53蛋白仅极少量表达,而EI组表达升高。免疫组织化学方法显示,S100A4和P53蛋白在EI组心肌和血管内皮细胞中均有表达;S100A4表达升高1.68倍,P53蛋白表达升高1.63倍。 二、S100A4蛋白的构建、表达、纯化与鉴定 根据大肠杆菌的密码子偏好性,重新优化并合成了大鼠S100A4基因,并在C端引入了6×His标签,经测序表明,合成的序列和预期结果完全一致,将该序列酶切后连接pBV220载体并转化大肠杆菌E.coli DH5α,经热激诱导后获得了高效可溶性表达,目的表达产物占菌体蛋白的20%以上,Western-blot分析表明,该蛋白是目的产物S100A4蛋白;表达产物破碎后取上清,采用金属螯合层析法进行纯化,最终获得了纯度95%以上的纯化制品,为进一步研究S100A4在氧化应激内皮细胞凋亡中的调控机制奠定了基础。 三、S100A4蛋白对氧化应激内皮细胞凋亡的调控机制研究 采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉内皮细胞。以浓度为100μmol/L的H2O2干预12h,成功建立内皮细胞氧化应激损伤模型。结果表明,H2O2可导致培养的内皮细胞氧化应激损伤,内皮细胞存活率下降28.67%,并诱发部分内皮细胞凋亡。外源性S100A4蛋白具有逆转氧化应激损伤,提高细胞存活率,抑制内皮细胞凋亡的作用。Western-blot结果表明,内皮细胞加入H2O2后,S100A4和P53蛋白表达水平升高。加入S100A4蛋白进行干预后,内皮细胞胞浆中P53蛋白量升高,而核P53蛋白量降低。加入S100A4蛋白的剂量与核P53蛋白水平降低的程度存在一定关系。提示,S100A4蛋白对氧化应激心血管内皮细胞凋亡的调控,可能是S100A4通过抑制P53入核,从而降低P53促凋亡的作用而发挥保护作用。 综上所述,力竭运动不仅可致心血管氧化应激损伤,还可诱发大鼠心血管内皮细胞凋亡;S100A4和P53蛋白在力竭运动氧化应激损伤大鼠心血管组织中表达升高;成功构建pBV220-S100A4表达载体,获得了高效可溶性表达,最终获得了纯度达95%的蛋白;建立了氧化应激致内皮细胞凋亡细胞模型,结果表明,氧化应激损伤可导致S100A4和P53蛋白表达水平升高。加入S100A4蛋白,可对细胞氧化应激损伤产生保护作用,提高内皮细胞存活率,抑制细胞凋亡;可以影响P53蛋白在氧化应激损伤内皮细胞中的分布,主要是增加P53在胞浆内的聚集,减少P53在核内的的水平,提示S100A4蛋白可阻抑P53由胞浆转入核内,推测这可能是S100A4蛋白对氧化应激内皮细胞凋亡调控机制的重要环节之一。


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