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用微卫星DNA标记技术建立猕猴遗传检测方法及对群体遗传多样性的分析

李瑞生  
【摘要】: 随着生物学、医学和药学的发展,对标准化实验猕猴的需求量不断增加,建立并提供遗传背景清楚的标准化实验猕猴,将对生命科学研究结果的准确性和可靠性提供有力保障。实验动物科学是生物医学乃至整个生命科学研究的基础和支撑条件,其发展和应用程度是衡量一个国家或地区科学技术水平高低的一个重要标志。但是,从整体水平看,我国实验动物工作的发展还不平衡,标准化进程和水平也不一致,尤其是实验猕猴等大型实验动物,不管是资源丰厚程度,还是自身的研究力度都相当薄弱。实验动物遗传质量监测是评价动物质量好坏的一个重要手段,其目的是为了验证各种动物品系应具有的遗传特性,检查是否存在杂合性、基因突变和遗传污染等,以确定被检对象是否符合该群体的生物学特性。 微卫星DNA标记技术由于其具有高度地灵敏性、特异性和多态性,方法简便、快速和廉价等特性,被广泛地应用到实验动物的遗传质量监测和遗传结构多样性分析中,是目前公认的物种遗传多样性评估的最佳分子遗传标记技术,也是实验动物遗传质量监测的重要手段。本实验研究通过优化各猕猴微卫星DNA位点的复性温度和Mg2+浓度等PCR扩增反应体系条件,从100个位点中筛选出D1S1594、D1S533、D3S3045、D21S1246、D7S513、D6S493、D6S2419、D4S1645、D5S820、D5S1470、D5S1466、D14S255、D15S644、D10S611、D20S171、D12S372、D2S1333、D12S67、D2S146、D11S2002、D11S1352、D9S934、D17S1290、D17S791、D13S797、D18S536、D18S869、D19S571、D19S559和D16S403等30个具有多态性高、等位基因数多和染色体上分布均匀的微卫星DNA位点。 利用这30个多态性微卫星DNA位点对北京地区恒河猴种群的28只个体的遗传结构进行了监测分析,其等位基因数均在7条以上,最高的达到了11条。应用Popgene3.2软件分别对其基因频率、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、基因多样性(H)和香隆信息指数(I)等指标进行了统计分析,结果其基因频率为0.0357~0.3214;观察等位基因数为7.0000~11.0000,平均为8.0814;有效等位基因数为5.1579~8.5217,平均为6.5449;基因多样性为0.8061~0.8827,平均为0.8453和香隆信息指数为1.7959~2.1682,平均为1.9606,这些监测指标较好地反映出该群体多样性的遗传结构特点,构建了恒河猴种群多态性微卫星DNA位点的DNA指纹判定图谱。 同时利用这30个多态性微卫星DNA位点对北京地区食蟹猴种群的28只个体的遗传结构也进行了监测分析,其等位基因数均在5条以上,最高的达到了10条。应用Popgene3.2软件分别对其基因频率、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、基因多样性(H)和香隆信息指数(I)等指标进行了统计分析,结果其基因频率为0.0357~0.2500;观察等位基因数为5.0000~10.0000,平均为7.1501;有效等位基因数为4.6118~8.3404,平均为6.4255;基因多样性为0.7832~0.8801,平均为0.8402和香隆信息指数为1.5702~2.1592,平均为1.8925,这些监测指标较好地反映了该群体多样性的遗传概貌,说明了该群体具有一定的杂合性和多样性,符合封闭群实验动物的基本要求,从而建立了食蟹猴种群多态性微卫星DNA位点的DNA指纹判定图谱。 为了进一步了解猕猴属中恒河猴亚种间以及恒河猴与食蟹猴群体间遗传结构的差异,本实验根据其在恒河猴和食蟹猴群体遗传结构分析中的等位基因数多、多态性好、图带清晰和染色体上分布均匀等特点,从中选取D1S1594、D1S533、D3S3045、D7S513、D6S2419、D4S1645、D5S1466、D15S644、D10S611、D12S67、D2S146、D11S1352、D13S797、D18S536和D18S869等15个多态性较好的微卫星DNA位点,利用这些位点对来源于北京地区、四川地区的各50只恒河猴(雌雄各半)和来源于北京地区自繁的50只食蟹猴(雌雄各半)等三个群体进行了遗传结构DNA多态性和群体间遗传距离的对比分析,结果所有的位点在三个群体中均呈现较高的多态性,其等位基因数均在8条以上,最多的达到了11条。食蟹猴群与两个恒河猴群体间的D1S533、D3S3045、D6S2419、D4S1645、D10S611、D12S67和D18S869等7个位点的等位基因数存在差异,利用这7个差异性微卫星DNA位点可以对食蟹猴群和恒河猴群进行有效地鉴别;对于北京地区和四川地区的两个恒河猴亚群间D12S67位点和D18S869位点的等位基因数存在差异,利用这2个差异性微卫星DNA位点可以对两个恒河猴亚群的遗传结构进行有效地鉴别分析。通过对三个猕猴群体等位基因数相同的微卫星DNA位点数比例的多少来反映群体间遗传距离的远近,结果两个恒河猴亚群间等位基因数相同的微卫星DNA位点数为13个,占总位点数的86.7%,高于北京地区和四川地区的恒河猴群与食蟹猴群之间等位基因数相同的微卫星DNA位点数,分别为9个和8个,占总位点数的60%和53.3%,说明了两个不同恒河猴亚群间的遗传距离比与食蟹猴群体间的遗传距离要近。 总之,本实验利用所筛选的具有高度多态性的微卫星DNA位点较好地反映了不同猕猴群体遗传结构多样性的遗传概貌,构建了猕猴群体遗传结构多样性的DNA指纹判定图谱,从而确立了恒河猴和食蟹猴微卫星DNA标记的分子遗传质量监测方法以及恒河猴与食蟹猴种群遗传结构的鉴别分析方法,填补了国内实验动物恒河猴和食蟹猴遗传质量监测方法的空白,为今后建立完整的猕猴种群遗传背景资源库,分析研究其基因配型、亲子鉴定和群体遗传距离,鉴别恒河猴不同亚种和食蟹猴种群,选择群体内最佳雌雄配对繁殖比例,指导恒河猴和食蟹猴的生产繁殖,建立血缘系谱明确、遗传背景清楚的猕猴个体都具有十分重要的意义。这也将为今后把分子遗传标记技术应用到实验动物的遗传质量监测中提供了有力的理论依据。


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