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大规模人类肝脏蛋白质相互作用网络研究

唐刘君  
【摘要】: 肝脏承担了物质代谢、胆汁分泌、生物合成和解毒等重要生理功能。蛋白质相互作用是蛋白质执行功能的重要方式,也是细胞功能调控网络的结构基础。肝脏蛋白质相互作用网络的研究,不仅可以认识肝脏生理功能的分子调控机理,发现蛋白质互相联系的内在规律,还可能发现许多未知蛋白质的功能和已知蛋白质的新功能线索,并有助于从网络层面上认识肝脏疾病发生机制,发现新的生物标志物和药物靶点。 本研究建立了适合规模化蛋白质相互作用发掘的酵母双杂交技术平台,并对人类肝脏重要蛋白质的相互作用进行筛选,采用多种方法对所获相互作用数据进行了评估,构建了人类肝脏蛋白质相互作用网络框架,进一步分析了该网络的特征及可能的生物学意义。论文分为两个部分: 一、人类肝脏蛋白质相互作用网络框架构建及特性分析。研究并发展了高通量阵列筛选技术、高通量质粒抽提技术、高通量转化细菌和酵母技术等,再整合已建立的高通量载体构建技术组成了大规模阵列式酵母双杂交技术平台,其通量达到每天筛选384×384阵列,即每天检测约15万个可能的相互作用。在此基础上以构建的总数约10000个酵母双杂交克隆的阵列库为起始,建立了系统的相互作用阵列交配筛选过程。约3500个诱饵质粒和5100个猎物质粒被分别转入MATα和MATa酵母菌株中,通过自激活实验淘汰不适合筛选的克隆。余下的克隆,每12个猎物克隆形成一个亚库(pool)与每一个诱饵克隆进行交配(mating)筛选,为第一轮一对库筛选(pooled mating)。筛选中能激活LacZ报道基因而在X-gal分析中呈阳性的二倍体酵母细胞被判断为候选阳性克隆。所有在第一轮筛选中被判为候选阳性的诱饵与相应的12个猎物分别进行一对一的第二轮杂交筛选,能激活HIS3和URA3报道基因而在四缺选择性培养板上生长和/或激活LacZ报道基因在X-GAL分析中呈阳性的克隆判断为阳性。只有能通过两次独立筛选的相互作用被计入真阳性。本研究共检测了超过1500万对的配对(3000诱饵与5000猎物),得到涉及939种蛋白质的991对相互作用,初步建立了人类肝脏蛋白质相互作用网络的基本框架。 为验证所获数据的可靠性,首先随机挑选了384对相互作用蛋白质进行一对一重-杂交(re-mating)验证,阳性率为87%。随后我们选出10对相互作用采用免疫共沉淀实验验证,结果8对为阳性,虽然,验证数据规模还较小,但仍提示在所获蛋白质相互作用数据中含有较多可被其它独立方法验证的相互作用,具有较高的可靠性。我们进一步采用生物信息学方法评价了数据的可靠性,包括已知相互作用分析和PRINCESS软件分析。结果发现在991对相互作用中有64对(占6.5%)为文献报道相互作用,这一比例高于Rual J.F.等报道的大规模人类蛋白质相互作用研究的比例3.4%(95/2754)。采用整合相互作用的功能相关性、定位、相互作用结构域、模式生物相互作用等信息发展的PRINCESS软件分析打分,410对相互作用得分大于2分,即超过40%为高可信度相互作用,该比例略高于其它两个规模化人类蛋白质相互作用研究数据的评分。这些结果表明我们获得的数据具有较高的可信度。 为了直观地描述相互作用形成的网络并分析网络的特点及其生物学意义,我们将获得的相互作用进行了可视化分析和网络拓扑结构分析,发现人类肝脏蛋白质相互作用网络具有类似其它真核生物蛋白质相互作用网络的小世界、无尺度特点。随后我们以实验数据、生物信息学分析和大量的文献调研为依据,试图从面、线、点三个层次挖掘信息,即面(对重要信号通路的调节网络)、线(重要生物学过程间的交联)、点(重要功能蛋白质的作用或调控机制)等,并从每个层次选一个实例进行了详细分析,即NF-κB信号通路的网络化调节、潜在的生物学过程间的交联—GATA2- Smad4的相互作用、揭示重要功能蛋白的作用机制—MCC-GTF2E2以及MCC-TCEB3的相互作用。为进一步挖掘和揭示获得数据的生物学意义奠定了基础。 二、人类肝脏代谢相关蛋白质相互作用蛋白质的发掘。物质代谢是肝脏功能的一个重要特点,同时阵列库所含蛋白质数量有限,为获得在阵列库中不包含的蛋白质的相互作用,我们选择人类肝脏代谢相关的27个蛋白质作为诱饵,对成人肝cDNA文库进行筛选。每种诱饵经文库转化至少获得超过1X106独立克隆。能激活三个报道基因中两个以上的相互作用克隆计入阳性。500个初步阳性克隆,其中三阳性克隆数128个,两阳性数372个,大约221个克隆被成功测序,其中符合阅读框的猎物为109条,去除冗余后获得73对相互作用。对这些相互作用对进行酵母回转验证,总体回转阳性率为52%,其中B、C类的回转阳性率为62%,提示我们的相互作用中可能存在一定的假阳性,需经其它方法进行验证。随后我们采用多种生物信息学分析方法,包括已知相互作用、基因共表达、GO (Gene ontology)功能注释、相互作用结构域、模式生物同源性比较和网络拓扑结构等,对所得相互作用的可信度和生物学相关性进行系统的评价。在我们的相互作用数据中,有4对已知相互作用,占所有相互作用的5.5%;有35对相互作用的猎物和诱饵共同出现在同一文献中;15对相互作用的诱饵和猎物具有相同的生物学功能或参与相同的生物学过程;8对相互作用的诱饵和猎物有相互作用结构域存在;1对相互作用具有模式生同源性。这些结果显示我们获得的相互作用具有较高的可信度,是对阵列法筛选获得人类肝脏蛋白质相互作用数据的有效补充。通过其它独立实验验证所获相互作用的工作目前正在进行之中。 本论文建立了高通量阵列式酵母双杂交技术平台,可为规模化开展不同物种和不同物种间如病原微生物蛋白质与人类蛋白质相互作用研究提供有效的技术支持。同时,构建的人类肝脏蛋白质相互作用网络,揭示了许多未知蛋白质的功能和已知蛋白质的新功能线索,并有助于从网络层面上认识肝脏生理功能调控和疾病发生机制,发现新的生物标志物和药物靶点。


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