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冰冻干燥血小板创伤修复作用的初步研究

高峰  
【摘要】: 血小板在创伤修复中具有重要作用。其主要原因是血小板中含有20多种生长因子,在创伤修复过程中发挥着增强细胞的趋化、增殖、血管生成和细胞外基质沉积等作用。富血小板血浆(PRP)是通常的血小板应用形式,激活后释放包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮细胞生长因子(EGF)等在内的大量生长因子,对细胞的迁移、分化和有丝分裂活性有极大的影响,并伴随着整个创伤修复期。由于创面愈合与组织修复是多因子协同作用与调控的生物学过程,因此与单一的基因重组生长因子相比,血小板含有的各种生长因子的比例接近生理环境、创伤修复的效果更好且安全无副作用。然而,由于PRP在22士2℃条件下振荡保存易污染,且储存和运输存在一定困难,限制了其应用。相比之下,冰冻干燥血小板具有体积小、重量轻、便于长期储存和运输的优点,备受人们的关注。因此,本研究采用小分子糖稳定剂对血小板进行冰冻干燥,并对冰冻干燥后的血小板的形态和功能进行评价;分析冰冻干燥血小板中生长因子种类和含量;将从血小板中提取的生长因子作用于人成纤维细胞,检测冰冻干燥血小板对修复细胞增值的促进效果;利用大鼠全层皮肤缺损创伤模型,评价冻干血小板和新鲜血小板促进皮肤创伤修复的效果;为研制新型促创伤修复制剂提供理论基础。 为了获得结构和功能保存完好的冰冻干燥血小板,首先对多种血小板冰冻干燥预处理保护液配方进行筛选,结果显示,经组方1、组方2和组方3预处理的血小板在预处理后细胞回收率分别为57.2%±8.1%、63.6%±11.7%和80.6%±13.9%,组方3的预保护效果显著优于组方1和组方2(P0.05)。采用组方3冰冻干燥血小板后,-20℃保存0d、30d、90d以及常温保存20d,再水化后血小板的回收率无显著差异(P0.05)。电镜下观察,冰冻干燥后血小板形态正常,膜结构完整,α-颗粒、致密颗粒及开放管道系统(OCS)仍稳定存在。体外聚集活性测定结果显示,冰冻干燥血小板保存不同温度和时间,其凝血酶诱导下的聚集活性与新鲜血小板相比,无显著差异(P0.05)。血小板提取液总蛋白含量的测定结果表明,-20℃保存0d、30d、90d和常温保存20d的冰冻干燥血小板总蛋白含量(mg/ml)分别为64.2±9.7、65.4±6.6、63.5±6.7、61.7±10.1与新鲜血小板(62.7±6.7)相比无显著差异(P0.05);ELISA法检测结果显示,-20℃保存0d、30d、90d和常温保存20d的冰冻干燥血小板PDGF-BB的含量(pg/ml)分别为497.74±98.54、517.26±95.45、534.17±102.38、501.97±98.37,TGF-β1的含量(ng/ml)分别为5.74±1.27、5.57±0.96、6.04±1.38、5.87±1.21与新鲜血小板(503.81±101.13pg/ml和5.67±1.28ng/ml)相比无显著差异(P0.05),结合以上两组实验的结果,推断-20℃保存0d、30d、90d以及常温保存20d的冰冻干燥血小板中的生长因子的含量是稳定的。 本研究从体外和体内两方面综合评价了冰冻干燥血小板促进皮肤创伤修复效果,测定了冰冻干燥血小板、新鲜血小板和rhPDGF对人皮肤成纤维细胞增值的促进作用,结果发现,随着血小板生长因子提取液在培养液中的比重增加,人皮肤成纤维细胞的增值率也逐渐增高,在比重达到40%时,新鲜血小板组和冰冻干燥血小板组成纤维细胞增殖率达到最高值,分别为168.4%±4.9%和167.6%±6.9%,二组之间无显著差异(P0.05),此时,rhPDGF-BB组人皮肤成纤维细胞增值率也达到最高值135.4%±5.1%,显著低于血小板组(P0.05),在PDGF-BB浓度相同的情况下,冰冻干燥血小板和新鲜血小板组的人皮肤成纤维细胞增值率均显著高于rhPDGF-BB组(P0.05)。体内实验中,建立大鼠全层皮肤缺损创伤模型,测定冰冻干燥血小板、新鲜血小板、rhPDGF-BB对大鼠全层皮肤缺损创面修复的促进效果,新鲜血小板治疗组大鼠创面愈合时间为(17.34±1.89)d,冰冻干燥血小板治疗组大鼠创面愈合时间为(17.76±1.61)d,rhPDGF-BB治疗组大鼠创面愈合时间为(20.88±1.34)d,未治疗组大鼠创面愈合时间为(22.16±1.29)d,治疗组大鼠创面愈合时间较未治疗组均明显缩短(P0.05),血小板治疗组优于rhPDGF-BB治疗组。免疫组化结果显示,实验第12d,未治疗组增殖细胞数据达到峰值,冰冻干燥血小板治疗组、新鲜血小板治疗组、rhPDGF-BB治疗组和未治疗组PCNA表达阳性细胞分别为123.6±5.84、128.84±6.28、167.22±7.25和173.45±4.16,未治疗组均显著高于血小板治疗组(P0.05),提示冰冻干燥血小板治疗组已经从肉芽增生期向再塑形期过度,这表明冰冻干燥血小板加快了创伤的愈合速度,且效果与新鲜血小板相近。 综上所述,本研究筛选出了冰冻干燥血小板预处理保护液,冰冻干燥再水化后,血小板形态、功能和生长因子都得到了有效的保护,与新鲜血小板相比无显著差异,无论是在体内还是体外实验中,冰冻干燥血小板都具有显著地促进皮肤创伤修复的作用,与新鲜血小板相比无显著差异,明显优于单一生长因子(rhPDGF-BB)的作用。


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