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肌腱细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠的研制与鉴定

扎拉嘎白乙拉  
【摘要】: 肌腱是人体重要的结缔组织,起到连接骨骼和肌肉并传递力的作用。肌腱组织的主要组成是胞外基质中的胶原纤维和镶嵌在胶原纤维内的肌腱细胞。肌腱细胞的功能是分泌各种胞外基质成分,形成具有刚性的肌腱胶原纤维。肌腱疾病发病率高而且很难治愈,治疗后的肌腱往往不能恢复原有功能,其病因与年龄和职业相关。目前肌腱发育与疾病相关的分子机制报道很少,缺乏肌腱细胞特异性Cre重组酶转基因工具小鼠是导致肌腱细胞遗传调控机制相关领域研究滞后的原因之一。 转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF–β)是转化生长因子β超家族的成员,包括TGF–β1、TGF–β2和TGF–β3。TGF-βs通过细胞膜上的I和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体(Transforming growth factor-βtype I receptor,TGF-βRI;Transforming growth factor-βtype II receptor,TGF-βRII)活化细胞内信号转导分子Smads而形式广泛的功能。Smad4是TGF–βs信号转导过程中的枢纽性分子,它与受体依赖的Smads结合调节下游靶基因的表达。大量的体外实验证明TGF–βs在肌腱组织胞外基质的分泌和肌腱粘连中发挥重要作用,但至今缺乏体内证据。 为了利用Cre/LoxP系统研究相关基因在肌腱中的功能,我们使用I型胶原α1基因3.6 kb启动子驱动Cre重组酶,研制了肌腱和成骨细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠(Col1α1-Cre)。通过显微注射的方法将6.9 kb的转基因片段Col1α1-Cre引入小鼠受精卵,获得子代小鼠16只,经基因型鉴定有2只小鼠在基因组上整合有Col1α1-Cre基因,整合率为12.5%。为了验证Cre重组酶在转基因小鼠中表达的组织分布及其在体内介导重组的功能,将Col1α1-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和ROSA26转基因小鼠交配。Col1α1-Cre;Smad4Co/+小鼠的多组织基因组DNA的PCR结果显示Cre重组酶在肌腱、长骨和顶骨中能介导LoxP间的基因重组。对Col1α1-Cre;ROSA26双转基因小鼠胚胎进行LacZ染色的结果显示,Cre重组酶在肌腱、长骨成骨细胞和顶骨成骨细胞特异性表达而在生长板软骨细胞与脑等其它组织中不表达。进一步对Cre重组酶表达时间的检测发现在Col1α1-Cre转基因小鼠中,Cre重组酶从胚胎期14.5天开始在成骨细胞中表达,从胚胎期15.5天开始在肌腱中表达。在以往的研究中使用了Prx1-Cre在肌腱中剔除目的基因。Prx1-Cre是从胚胎期9.5天开始在肢芽中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,Cre重组酶在肌腱细胞、上皮细胞、软骨细胞等四肢所有细胞类型中均有表达。相对于整个四肢均表达Cre重组酶的Prx1-Cre转基因小鼠,我们构建的Col1α1-Cre转基因小鼠只在肌腱和成骨细胞中表达Cre重组酶,可以作为研制肌腱细胞特异性基因敲除小鼠的理想工具小鼠。 我们利用Col1a1-Cre转基因小鼠研制了肌腱细胞特异性TGF-βRII基因敲除小鼠。肌腱细胞特异性TGF-βRII基因缺失导致突变小鼠出生后全身瘫痪很难行动。在正常肌腱组织中肌腱细胞是沿着胶原纤维有序排列的,通过组织切片可以清晰地看到极性排列的细长成纤维细胞。相对于对照小鼠,TGF-βRII基因敲除小鼠肌腱细胞呈多种形态且不极性排列。Real-time PCR结果显示肌腱胞外基质主要成分I型胶原和III型胶原的mRNA水平显著下降,同时肌腱重要的标记分子碱性螺旋-环-螺旋转录因子(Scleriex)和腱调蛋白(Tenomodulin)的mRNA含量在突变小鼠中也明显下降。透射电镜的结果证明突变小鼠胶原纤维直径要小于对照小鼠,提示敲除小鼠肌腱发育和胞外基质分泌异常。肌腱细胞特异性Smad4基因敲除会导致胶原束直径变小而且分布异常,反映了敲除小鼠肌腱刚度下降和发育异常。以上实验提示TGF-β信号通路在肌腱细胞胞外基质的分泌中可能起重要作用。 综上所述,本研究研制的Col1a1-Cre转基因小鼠在肌腱细胞中特异性表达Cre重组酶,为研究肌腱细胞的分化和稳态维持的遗传机理提供了宝贵的新的工具小鼠。


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