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狂犬病毒胶体金检测试纸的制备与初步应用

王铁成  
【摘要】: 狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病,一旦发病,病死率高达100%,是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,每年导致全球五万多人发病死亡,是发展中国家严重的公共卫生问题。人感染狂犬病的主要原因是人直接或间接与带毒动物(犬、猫等)接触引起的。研究表明,大多数感染狂犬病毒的犬在临床症状出现前、出现时或出现后的短时间内,就开始了病毒排出,因此,开展狂犬病流行病学调查,并对狂犬病病原的诊断十分必要。 胶体金免疫层析技术因其具有方便、快速、灵敏、特异等特点,在动物疾病诊断方面越来越受到人们的关注。本实验采用双抗体夹心法研究用于狂犬病病毒检测的胶体金试纸条。用狂犬病毒单克隆抗体纯化的IgG标记胶体金,兔抗狂犬病毒多克隆抗体纯化的IgG包被试纸条的检测线,羊抗鼠IgG用于质控线的包被。经纯化的ERA株狂犬病毒免疫Balb/C小鼠,制得两株(MRV201、MRV301)抗狂犬病毒单克隆抗体,经亚型鉴定试剂盒和western-blot鉴定分析,MRV201和MRV301分别为IgGI和IgG2b,均为抗狂犬病毒核蛋白单抗。用饱和硫酸铵和Protein-G柱纯化后,紫外分光光度计测得所纯化的IgG最高浓度为2.36mg/mL;经庶糖梯度离心纯化ERA株狂犬病毒(浓度为5mg/mL)免疫家兔,制备抗狂犬病毒多克隆抗体,经中和抗体实验检测效价为1:128,用固体硫酸钠和Sephadex G-200柱的方法纯化多抗,经SDS-PAGE分析,该方法纯化的IgG无其它杂蛋白;使用的羊抗鼠IgG的浓度为0.8mg/mL。 鉴于多种因素对试纸条特异性和敏感性的影响,本研究对主要影响因素进行了优化组合,所制备的狂犬病毒抗原检测金标试纸用于狂犬病阳性乳鼠脑组织及狂犬病病毒细胞培养液检测均得到与FAT检测一致的结果,为狂犬病胶体金临床诊断方法的建立奠定了良好基础。


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