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模式病毒(噬菌体)分离、特性及在防护装备和设施评价中的应用研究

于龙  
【摘要】: 自20世纪70年代以来,在世界范围内发现和确认的新发传染病已多达40余种,在这些传染病中约50%可通过空气传播,而且几乎每年至少有一种新的传染病被发现,它们对人类健康、社会经济发展造成了严重的威胁。如2003年爆发的SARS,仅9个月,全世界30个国家有8439人感染,812人死亡;2004年起发生的高致病性禽流感;以及去年爆发的甲型H1N1流感,均造成了人员和财产的重大损失。 防护装备和设施在隔离传染源、阻断微生物气溶胶的传播途径和保护易感人群三方面均发挥着重要作用,在面对大范围未知生物恐怖袭击事件、自然突发事件时,是阻止疫病扩散最快最有效的方式之一,可起到立竿见影的效果。尽管如此,有些防护装备和设施仍然存在生物学防护效果评价方法或标准不完善甚至缺乏的情况。 本研究旨在建立和完善生物防护装备和设施对呼吸道病毒替代病毒气溶胶防护效果评价技术与平台,提升对生物防护装备和设施进行模拟病毒气溶胶防护效果评价的检测能力;开展对生物防护口罩、生物防护服、正压医用防护头罩、负压隔离转运舱、负压救护车排风净化装置、Ⅱ级生物安全柜和高等级生物安全实验室排风系统等生物防护装备和设施的安全性能评价。 内容: 1.从污水中分离大肠杆菌和粘质沙雷氏菌噬菌体并对其生物学特点进行系统研究; 2.研究模式病毒耐受发生和采样压力特点; 3.建立和完善生物防护装备和设施评价技术与平台并对多种防护装备和设施进行病毒气溶胶防护效果测试评价; 方法: 1.采用四步法从污水中分离大肠杆菌和粘质沙雷氏菌噬菌体,通过单层平板噬菌斑和双层平板噬菌斑实验筛选烈性噬菌体,挑取单个典型噬菌斑进行噬菌体的培养增殖及纯化,电镜观察噬菌体的形态,对噬菌体最佳感染复数、一步生长曲线特点、紫外线灭活特点、噬菌体宽噬性进行了研究,手工提取噬菌体核酸并进行电泳分析,对噬菌体结构蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析; 2.在密闭柜内使用玻璃发生器Devilbiss 40发生模式病毒气溶胶,发生液分别选用肉汤、SM液和PBS,TSI-3321气溶胶粒子分析仪测量空气中模式病毒气溶胶粒子谱,分别于发生前后取少量发生液,双层琼脂平板法测定噬菌体滴度,使用统计软件对结果进行分析; 3.使用全玻璃液体冲击式采样器(AGI-10)对模式病毒进行耐冲击实验,采样液选用蒸馏水(DW)、磷酸盐缓冲液(PBS)和SM液,每种采样液又分为加橄榄油组和不加橄榄油组,在以7L/min的气流冲击30min后测定采样液中噬菌体滴度和终末采样液体积,采用校正存活率评价噬菌体耐冲击性,使用统计软件对结果进行分析; 4.发生模式病毒气溶胶,空气微生物采样器采集防护装备和设施气溶胶暴露区和被保护区空气中模式病毒粒子,采用防护效率评价防护装备和设施对病毒气溶胶的防护效果。 结果: 1.成功分离出粘质沙雷氏菌烈性噬菌体2株(SM701、SM702),噬菌体SM701和SM702在双层平板上分别培养6h和8h后可出噬菌斑,前者噬菌斑形态为圆形,直径1mm左右(培养12h),噬菌斑透亮度较高;后者噬菌斑圆形,直径2mm~3mm左右(培养12h),透亮度较前者低。两株噬菌体形态极为相似,均有一个正多面体立体对称的头部,头径约64nm,无囊膜,有一长尾,无收缩尾鞘,尾长约143nm。两者最佳感染复数均为10。SM701感染宿主菌的潜伏期约为30min,爆发时间约为100min,裂解量约为63;SM702感染宿主菌的潜伏期约为40min,爆发时间约为90min,裂解量约为5。SM701和SM702在紫外线(光强221μW/cm2)下分别暴露14min和16min全部失活。噬菌体SM701和SM702核酸类型为dsDNA,衣壳和尾至少分别由14和16个不同大小蛋白构成,两者之间相似大小条带8条。 成功分离出大肠杆菌(285)烈性噬菌体2株(EcP1、EcP2), EcP1噬菌斑直径3mm~5mm(培养12h),逆光观察噬菌斑呈全透明状,该噬菌体有一个长多面体立体对称的头部,头长径(L)约47nm,头横径(W)约35nm,L/W=1.34,无囊膜,有一短尾,尾长约20nm;EcP2噬菌斑直径约1mm(培养12h),逆光观察噬菌斑呈全透明状,该噬菌体有一个长多面体立体对称的头部,头长径(L)约89nm,头横径(W)约54nm,L/W=1.65,无囊膜,有一长尾,有尾鞘,尾长约81nm。EcP2可噬大肠杆菌(8099)形成直径约1mm的圆形噬菌斑。EcP1和EcP2最佳感染复数分别为10和0.1,在紫外灯(光强221μW/cm2)下暴露8min和4min可全部失活。EcP1和EcP2核酸类型为dsDNA,衣壳和尾至少分别由12和16个不同大小蛋白构成。 2.在19.5min内,发生器Devilbiss 40对悬液中噬菌体活性影响小,影响随模式病毒和发生液的不同而不同;不同发生液之间发生前噬菌斑数差别无统计学意义(P0.05),发生后19.5min三种不同发生液之间噬菌斑数差异具有统计学意义(P0.01),均值结果为肉汤SM液PBS,说明相同滴度的噬菌体,使用三种不同的发生液,发生一定时间后,噬菌体活性之间差别显著,使用肉汤作为发生液对噬菌体的保护作用最好,不同模式病毒气溶胶粒子数量中值直径在0.7μm到0.8μm之间。 3.同一种噬菌体在不同采样液中,耐冲击性不同,以SM液作为采样液时,噬菌体存活率较高,SM液中是否加入橄榄油对噬菌体的耐冲击性没有影响。噬菌体SM701、SM702、PhiX174、EcP1和F2在SM液中经7L/min的气流冲击60min后,校正存活率分别为79%、77%、86%、50%和71%左右。在短时间(10min)内,噬菌体SM701、SM702、PhiX174和f2存活率无差别。 4.国内市售医用防护口罩质量良莠不齐,随检测产品的不同病毒学检测达标率为0、20%、60%和100%;正压医用防护头罩对病毒气溶胶的防护效率大于99.98%;从医用防护服测试结果来看,我国目前没有能够达到国际标准ISO16604的市售防护服;固定式和充气式负压隔离转运舱病毒气溶胶隔离效率均大于99.999%;负压救护车排风负压净化装置病毒气溶胶过滤效率大于99.99%;三级生物安全实验室中9块被检测HEPA中,有1块HEPA存在模式病毒气溶胶漏;生物安全柜检测结果表明,不同指示微生物在人员、产品和交叉污染保护实验中结果无明显差异,但高效空气粒子过滤器生物学检漏结果随指示微生物是细菌还是病毒而不同。 结论: 1.四步法是一种有效的噬菌体污水分离方法; 2.噬菌体SM701和SM702属于长尾噬菌体科噬菌体,噬菌体EcP1和EcP2分别属于短尾噬菌体科噬菌体和肌尾噬菌体科噬菌体; 3.成功分离的噬菌体SM702易于培养计数且对发生和采样冲击压力耐受,是理想的空气微生物学研究示踪微生物;营养肉汤是理想的气溶胶发生液;SM液是理想的液体冲击式采样器采样液; 4.噬菌体SM702可模拟病毒气溶胶对多种生物防护装备和设施病毒气溶胶防护效果进行评价; 5.成功建立和完善了生物防护装备和设施病毒气溶胶防护效果评价技术方法。


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1 于龙;王晓东;李卫鹏;李劲松;;噬菌体作为模式病毒的应用研究概况[J];中国消毒学杂志;2011年01期
2 李燕;李莎;张翌;张磊;王三应;杨旭;杨继红;;噬菌体作为室内空气模式病毒的初步研究[J];环境与健康杂志;2010年02期
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