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内含子miRNA反馈调节其宿主基因表达和功能的研究

黄宝春  
【摘要】: microRNA是近年来非编码RNA研究的热点。miRNA是一类约22nt大小的内源RNA,它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达,可以在转录后水平对许多基因的表达起着重要的调控作用,参与发育、细胞增殖、凋亡、糖代谢、应激和肿瘤的发生的生命活动。目前认为,大多数miRNA首先是通过pol II启动子转录,产生较长的,带有帽子结构和约80nt茎环结构的初始转录元(pri-miRNA),然后通过两种RNase III酶(Drosha和Dicer)加工成为成熟的miRNA,并组装成复合体(RISC或miRNP)。miRNA作为引导者,通过其5`端7~8 nt的种子区序列与靶基因的3′非翻译区序列的完全互补,介导靶基因mRNA水平的降低或者抑制其蛋白的翻译。随着研究逐渐深入,各种miRNA的功能越来越被了解。根据miRNA在基因组中的定位将其分为两类——基因间miRNA和内含子miRNA。内含子miRNA的研究逐渐引起人们的关注,它们来自编码蛋白基因(宿主基因)的内含子中,大多数的内含子miRNA与其宿主基因的表达具有一致性,这就提示它们之间在功能上有一定的关联。文献也报道有一些内含子miRNA能够反馈调节其宿主基因的表达和功能。本研究研究的目的就是对这种反馈调节的普遍性进行进一步的探究。 本研究分主要为两部分: 第一部分:A549细胞中miRNA-301反馈调节其宿主基因Ska2的表达和功能 肺癌是全世界癌症死因的第一位,而且每年死亡人数都在上升,因此肺癌成为众多肿瘤中的研究热点。我们发现肺腺癌A549细胞中内含子miRNA-301表达很高,用miRNA-301特异抑制剂降低内源性miRNA-301后发现其宿主基因的表达下调,同时A549细胞的分裂指数增加和克隆形成能力降低,这与用siRNA敲除其宿主基因Ska2产生的效果相同,说明miRNA-301在表达和功能上反馈调节其宿主基因。为找到miRNA-301反馈调节其宿主基因的信号通路,我们首先通过生物信息学确定miRNA-301的直接靶基因——MEOX2,后续的荧光素酶试验和mRNA表达水平实验进一步证明MEOX2是miRNA-301的靶基因。MEOX2的功能是抑制ERK信号通路。在A549细胞中由于miRNA-301的高表达导致MEOX2表达下降,进而ERK信号通路加强。ERK信号通路的加强增加其下游分子——CREB的活性。通过生物信息学和ChIP实验证实CREB是Ska2的转录激活因子,CREB的活性增加从而导致上调Ska2的表达。同时还发现CREB还上调Ska2的相互作用蛋白Ska1,这就说明miRNA-301功能上反馈调节其宿主基因的功能。CREB是肺癌发生中重要因子,由于它的活性增加导致其下游的相关癌基因——如c-fos和egr1高表达,这可能是肺癌发生的一个重要原因。本部分的实验结果一方面说明内含子miRNA-301在A549细胞反馈调节其宿主基因Ska2,另一方面为肺癌的发生提供一种可能的机制。 第二部分:内含子miRNA反馈调节其宿主基因表达现象的普遍性研究 我们第一部分的研究和已发表文献表明这种反馈调节可能有一定的普遍性。直接验证内含子miRNA对其宿主基因功能上的反馈调节有难度,所以我们先从其对宿主基因表达上的反馈调节入手。为验证这种普遍性,我们我们从Sanger数据库将所有的miRNA下载,从中找出高度保守的内含子miRNA(大约65个),再参考ambion的miRNA在常见癌细胞中表达谱,从中再找出在我们所选的五个细胞系(HeLa、HepG2、A549、MCF-7、T24)中大部分较高表达的10个miRNA,分别是miR-26a/93/107/140-5p/191/153-1/196b/208a/218-1/338-5p。根据它们的序列合成它们的抑制(二氧甲基化的反义寡核苷酸)。然后将这些抑制剂分别转染上述五种细胞中,48小时后提总RNA,反转录,通过实时定量PCR检测它们宿主基因的表达变化。实验的结果表达大部分的miRNA会对其宿主基因的表达产生反馈调节,同时我们也发现在不同的细胞系中这种反馈调节的方向不同,譬如说miRNA-93在HeLa细胞中正向反馈其宿主基因MCM7,而在HepG2细胞中miRNA-93却是反向反馈其宿主基因MCM7。这部分结果为内含子miRNA的存在和功能提供了更好的理解。


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