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KAI1对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及其机制研究

肖凤君  
【摘要】: 多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是浆细胞恶性增生性血液肿瘤,发病率较高,预后较差。其主要特征为:分泌单克隆免疫球蛋白,并伴有免疫球蛋白减少及广泛溶骨病变和(或)骨质疏松。目前除了造血干细胞移植之外,标准的化疗方案仅能部分缓解病情,且在治疗过程中易发生耐药和复发,从而导致治疗失败。因此,进一步阐明疾病发生、发展的分子与细胞机制,对于寻找药物靶标,最终攻克该病具有十分重要的意义。 肿瘤细胞癌基因的激活或抑癌基因的沉默,是决定肿瘤发生、发展的重要因素。KAI1,又称CD82,是重要的抑癌基因,广泛分布于正常机体组织中,在前列腺、肺脏、肝脏、膀胱、骨髓和胎盘中表达丰度较高。作为4次跨膜超家族(transmembrane4super-family,TM4SF)成员,KAI1拥有4个跨膜区,跨膜区有一些高度保守的具有极性的氨基酸。已有研究表明,KAI1在细胞的聚集、粘附、迁移和增殖中均有明显的调控作用。本实验室的前期研究表明KAI1能够抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移,并有效诱导凋亡。藉此思路,本研究以CD82为靶标,探讨了其对骨髓瘤细胞生物学性能的影响及其可能机制,希望能够为骨髓瘤的治疗寻找有效的药物靶标。 为研究KAI1对骨髓瘤细胞生物学特性的影响,我们首先对本实验室构建的重组腺病毒Ad5-KAI1进行了大量扩增和纯化,采用紫外分光光度法检测OD260nm和OD280nm吸光值,计算病毒的纯度及颗粒滴度。结果显示,重组病毒的纯度为1.37,颗粒滴度为2.97×1012Vp/ml;快速CPE法和TCID50法(极限稀释法)检测病毒的感染滴度分别为1×1011pfu/ml和6.3×1010 IU/ml,病毒的感染滴度与颗粒滴度的比值约为47:1,符合要求。上述结果表明,我们纯化得到了高纯度、高滴度的重组腺病毒Ad5-KAI1,为进一步功能实验提供了有效的工具。 为探讨骨髓瘤细胞KAI1的表达情况,我们采用流式细胞术对骨髓瘤细胞系和原代多发性骨髓瘤病人CD138+细胞表面的KAI1分子进行了检测。结果显示,在骨髓瘤细胞系XG-7、SKO-007、U-266细胞表面几乎检测不到KAI1表达;而在磁珠分离得到的两例骨髓瘤病人的CD138+细胞中,KAI1阳性细胞所占的比例分别为17.8%和16.7%。结果表明,无论在骨髓瘤细胞系还是原代细胞中,KAI的表达均受到明显的抑制。 为确定KAI1对骨髓瘤细胞感染的最佳感染滴度,我们分别以Ad5-GFP和Ad5-KAI1感染骨髓瘤细胞SKO-007,荧光显微镜和流式细胞术检测重组腺病毒的感染效率及KAI1的表达效率。结果显示,50MOI、100MOI和200MOI的Ad5-GFP对SKO-007的感染效率在24h均可达到99%以上;100MOI的Ad5-KAI1感染细胞后24h,KAI1的表达效率能够达到90%左右,而且细胞状态良好。结果提示,后续的功能实验可以100MOI作为最佳感染强度。 获得重组腺病毒Ad5-KAI1及其最佳感染强度之后,我们以SKO-007细胞为模型,探讨了Ad5-KAI1对细胞增殖、迁移和凋亡等生物学特性的影响。(1)KAI1对细胞增殖的影响:分别采用CCK-8法和CFSE标记法检测了Ad5-KAI1对SKO-007增殖的影响。结果表明, KAI1能明显抑制SKO-007的增殖。(2)KAI1对细胞迁移的影响:Transwell细胞迁移实验的结果显示,与对照相比, KAI1能够有效抑制SKO-007细胞的迁移;也能明显抑制HGF的促细胞迁移作用。(3)KAI1对细胞凋亡的影响:通过Annexin V、PI双标法检测细胞凋亡,结果显示,与对照相比,KAI1能够明显促进SKO-007细胞的凋亡。上述结果表明:KAI1能够抑制骨髓瘤细胞系SKO-007细胞的增殖和迁移作用,并能促进细胞凋亡。 为进一步探讨KAI1影响骨髓瘤细胞生物学效应的机制,我们对相关信号通路进行了研究。首先,我们通过流式细胞术及Western Blot证实KAI1能够明显上调SKO-007细胞Caspase3和PARP的表达,Caspase3抑制剂能够抑制Ad-KAI1诱导的促凋亡作用。结果表明,KAI1通过Caspase3依赖的途径促进细胞凋亡。另外,通过Western Blot证实KAI1能明显上调骨髓瘤细胞ERK磷酸化水平,表明KAI1能上调细胞应激性保护信号ERK。为了证实KAI1与ERK信号相关,我们在实验体系中加入ERK特异性的抑制剂PD98059,发现抑制ERK信号通路后KAI1诱导的凋亡比未加抑制剂组明显增强,说明KAI1通过ERK信号途径的应激性细胞保护促进细胞凋亡。KAI1能部分抑制HGF促SKO-007细胞的迁移作用,那么,KAI1能否抑制HGF对ERK磷酸化的上调作用?Western Blot的结果表明HGF可以显著上调骨髓瘤细胞ERK的磷酸化,而感染KAI1后,骨髓瘤细胞ERK的磷酸化程度与是否加入HGF无关。另外我们还初步观察了KAI1作用于骨髓瘤细胞后AKT和STAT3通路信号分子的磷酸化情况,结果发现KAI1能够抑制AKT的磷酸化,但是对STAT3的磷酸化水平没有明显影响。上述结果表明KAI1对骨髓瘤细胞生物学特性的影响是多信号多途径的调控过程。 综上所述,KAI1能够调节骨髓瘤细胞的生物学特性,包括抑制增殖和迁移,促进凋亡等。对其机制研究表明,由MAPK、AKT等多条信号途径多种信号分子参与KAI1对骨髓瘤细胞生物学特性的调控。本研究为进一步阐明KAI1调控骨髓瘤细胞的机制提供了实验基础;同时,为研发多发性骨髓瘤的新药靶提供了思路。


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