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结合~(18)O同位素标记和质谱多反应监测技术的蛋白质定量策略建立及其在肝癌生物标志物研究中的应用

赵焱  
【摘要】: 生物标志物的研究是医学领域关注的热点。采用蛋白组学的方法已经大大加快了生物标志物的研究进程。基于二维凝胶电泳或生物质谱技术的差异蛋白质组学通过比较正常和疾病状态下蛋白质的表达水平变化,获得了大量生物标志物候选蛋白质。这些蛋白质必须经过严格的确证和临床验证才能最终成为临床可使用的生物标志物。而目前基于免疫原理的经典确证方法,由于制备高特异性抗体的难度高,建立方法周期长成本高,已经不适用于大规模的生物标志物候选蛋白质的确证,成为整个生物标志物研究流程中的瓶颈。基于质谱多反应监测(MRM)技术的SID-MRM-MS定量检测方法,不需要抗体制备,方法建立周期短,成本低,能在同一样品中对多个生物标志物候选蛋白质进行同时测定,并且能特异性地分析翻译后修饰蛋白质,在生物标志物的确证环节中显示了极大的优越性。 尽管SID-MRM-MS方法已经得到了蛋白质组研究领域的广泛认可,但其应用于规模化生物标志物确证所具有的低成本高通量优越性却由于稳定同位素内标获取困难无法展现。目前采用的稳定同位素内标制备方法在满足大规模生物标志物确证研究的要求上存在缺陷:以同位素标记的氨基酸为原料制备内标,耗时耗力,价格昂贵;采用蛋白质重组方法合成同位素标记内标,纯化复杂,化学计量值固定,不能方便地以接近真实内源性肽段浓度的比例加入样品进行分析;化学衍生引入同位素标记,在标记内标的同时,还需要进行目的蛋白酶切混合物的标记,影响定量准确性。 本论文研究的目的是发展方便快捷适于大规模内标制备的同位素引入方法,与MRM技术结合,建立普适性高通量的SID-MRM-MS定量方法,并用于临床肝癌血清样本中生物标志物候选蛋白质的确证。本论文由4个部分组成。第一章介绍了MRM质谱检测技术的原理及特点,概述了基于该检测技术的研究策略,以及该技术在翻译后修饰、蛋白质与RNA相互作用、生物标志物定量验证中的应用。最后结合当前研究背景提出了本课题的研究内容。 第二章阐述了基于~(18)O稳定同位素标记的内标制备策略的建立和优化。该研究针对目前~(18)O标记反应标记效率不稳定,标记产物容易发生可逆回交的不确定因素,优化了反应条件,确保了反应的可靠性,最后首次将该技术应用于绝对定量内标的制备。首先加入酶切促进剂RapigestTM SF改善肽段的分散度,改变辅助加热方式从传统的水浴加热变为微波加热来提高反应效率,最终在减少标记时间的同时获得了对标准肽段100%的标记效率;然后通过高浓度还原剂和烷基化试剂对溶液中残留的胰酶彻底灭活,抑制了~(18)O-16O回交反应,确保了标记产物连续六天的稳定性;最后,考察了~(18)O标记前后肽段进行MRM检测的特异性,标记前后的肽段能互无干扰地获得质谱信号,保证了其用于绝对定量的可靠性。我们的研究表明,优化后的~(18)O标记策略,适用于不同理化性质肽段的标记,能方便快速、有效稳定地标记多肽合成内标,满足了绝对定量分析的需要,为规模化的同位素内标制备提供了新选择。 肝癌血清生物标志物候选蛋白质vitronectin和clusterin,在恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用。本实验室早期的研究表明两者在血清中的表达水平变化与肝功能受损密切相关。为了方便快捷地同时确证两个标志物候选蛋白质在临床血清中的差异变化,本研究第三章阐述了结合~(18)O同位素标记方法,建立的基于MRM质谱检测技术的蛋白质绝对定量策略,并且将该策略用于中等规模的临床血清样品中肝癌生物标志物vitronectin和clusterin的差异确证。首先针对血清样品多组分高动态范围的高度复杂性,优化了MRM检测条件,改善了样品预处理过程,设计了液相色谱分离条件,满足了多个血清样本的高通量测定要求。然后,严格考察了方法绝对定量的可靠性,包括特异性、精密度、准确度、预处理回收率、测定重复性以及定量线性。方法学验证结果显示,在0.4~40 fmol/μL的浓度变化范围内定量测定线性相关性良好,r2值大于0.99。蛋白质最低定量限为0.4fmol/μL。精密度RSD11.96%,准确度RE%20%。预处理回收率大于87%,测定重复性RSD6.87%。最后,建立的方法被应用于20例含有10例健康和10例肝癌血清的临床样本检测,结果显示两种蛋白在肝癌血清样品中的下调变化,展现了作为生物标志物的潜在可能性。本研究创新性地将~(18)O同位素标记方法和MRM质谱检测技术相结合建立了方便灵活高准确度、高特异性、高重现性的蛋白质绝对定量方法,促进了SID-MRM-MS策略在生物标志物确证领域中的广泛应用。 蛋白质的核心岩藻糖化修饰与肝癌的发生发展具有更密切的相关性。但目前的研究技术,由于在质谱检测时完全切除了糖链,丢失了核心岩藻糖化信息,增加了分析的假阳性结果。因此,在第四章中,我们通过简化糖链,在质谱检测时保留部分糖基化信息,并且结合优化的~(18)O同位素标记方法,首次建立了基于MRM质谱检测的生物标志物核心岩藻糖化水平相对定量确证策略。本研究首先对核心岩藻糖化修饰的糖链进行了简化,保留了二糖结构,在此基础上对糖链简化后的核心岩藻糖化糖肽进行了三级四极杆型质谱碎裂行为探讨,为发展基于MRM的定量策略奠定基础;然后,结合~(18)O同位素标记技术,发展了血清中核心岩藻糖化肽段的MRM相对定量技术策略,对18例临床血清样本中6个生物标志物候选蛋白质的7个糖基化位点进行了相对糖基化水平的检测。最后,结合总蛋白质水平变化信息确证了核心岩藻糖化蛋白质Alpha-2-macroglobulin和Ceruloplasmin在肝癌和正常组血清中的糖基化修饰变化。本研究建立的高特异性核心岩藻糖化定量策略,首次提供了精确到位点的核心岩藻糖化修饰定量变化信息,并且从总蛋白质水平和核心岩藻糖化修饰水平两个层次阐释了生物标志物候选蛋白质在健康和肝癌血清中的变化,为翻译后修饰的生物标志物确证研究提供了详细信息。


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