基于衍生化与LC-MS~n联用研究生物样品中难测定药物的定量测定及其在药代动力学中的应用

【摘要】： 体内药物分析是药代动力学研究的基础。药代动力学研究中,由于药物受给药剂量、生物利用度、代谢转化等多种因素的影响,通常在生物样品中浓度低,杂质干扰大,因此需要高灵敏度和高专属性的分析方法研究药代动力学。LC-MSn技术特异性强,灵敏度高,可以多组分同时检测,已成为药代动力学研究中广泛使用的主要研究手段。随着LC-MSn的广泛应用,其应用的一些局限性也逐渐显现出来。如一些药物难电离而导致灵敏度差;一些有机小分子药物由于保留差,生物样品分析时,易受内源性物质的干扰而产生很强的基质抑制等。 本文首先应用化学衍生化,改变LC-MSn难测定药物的化学结构而改变其物理和化学特性,再应用LC-MSn实现生物样品中难测定药物的定量测定。通过化学衍生化的方法,可以改善药物在LC-MSn检测中的色谱与质谱行为,从而达到提高检测灵敏度、降低生物基质内其他杂质的干扰和降低基质抑制的目的。另外,本文还将亲水作用色谱技术应用于生物样品中药物的定量分析,并将衍生化或/和亲水作用色谱技术与LC-MSn相结合,实现了一些生物样品中难测定药物的定量分析。 本文将难测定药物按照官能团进行分类,包括酚羟基、醇羟基、酮和醛、羧基和胺基,每种官能团选择几个代表药物,研究衍生化反应。首先寻找有助于提高LC-MSn检测性能的衍生化试剂,同时要求衍生化试剂具有衍生化反应效率高、操作简单快速,定量生成稳定衍生物的特点。根据初步研究分别确定酚羟基的衍生化试剂为丹磺酰氯(Dansyl chloride,DNS-Cl);酮和醛的衍生化试剂为对甲基磺酰肼(Toluene sulfonyl hydrazine,TSH);羧基采用甲醇和乙醇为衍生化试剂;醇羟基衍生化试剂为甘油三甲基铵(Glycidyltrimethylammonium,GTMA);胺基衍生化试剂为氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC-Cl)。 在确定衍生化试剂的前提下,对可能的影响因素进行考察,主要包括反应温度、时间、催化剂的种类和浓度、溶剂的种类和衍生化试剂的浓度等。并比较衍生化前后的色质谱行为的改变,评价衍生化反应对LC-MSn检测生物样品中含各官能团的代表药物的作用。 ①通过对DNS-Cl和含酚羟基代表药物KL-1、丹皮酚、咖啡酸(双羟基)和大黄酚(双羟基)的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应系统为乙腈系统;衍生温度为60 oC;衍生时间为10 - 15 min;;缓冲盐pH为10 - 10.5;水相和有机相的比例约为1: 3 - 1: 5,依据药物的不同而不同。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加233;由于酚羟基不易电离,通过衍生化引入易电离的叔胺基团,可显著提高含酚羟基药物的离子化效率从而提高检测灵敏度。同时由于衍生化物非极性增大,色谱保留时间延长和色谱峰形改善。 ②通过对TSH和含酮基的孕二烯酮、米非司酮和丹皮酚的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应温度在40 oC - 60 oC之间,反应时间为≤8 h,催化剂三氟乙酸浓度在0.5 - 5 %之间时。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加168;由于反应生成更加易于质谱电离的腙,所以色谱行为主要表现为灵敏度提高。 ③通过甲醇或乙醇和含羧基代表药物L20051117、FS-3和SH-1(双羧基)的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应体系盐酸/甲醇和盐酸/乙醇比例均为1:9;反应的衍生温度为60 - 70 oC;衍生时间为20 - 40 min。甲基化质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加14,乙基化增加28。羧酸一般在ESI模式下检测灵敏度不高,在复杂生物基质中由于基质效应和高背景噪音,有时直接测定不能满足体内生物样品的检测灵敏度要求。当在药物的羧基上引入甲基或乙基后,可以通过增加药物检测的m/z和增加药物的保留时间,降低基质抑制和高背景噪音来提高质谱检测的灵敏度。 ④通过对GTMA和醇羟基代表药物伏格列波糖、半乳糖、D-木糖和葡萄糖的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应温度约为55 oC,反应时间≥4 h,衍生化试剂的浓度为50 %,催化剂浓度为1 N。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加116。同样,通过衍生化引入易电离的叔胺基团,可以显著提高单糖类药物的检测灵敏度,显著改善峰形和显著提高信噪比,使液质测定单糖类药物成为可能。 ⑤通过对FMOC-Cl和加巴喷丁的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:衍生化温度为40 oC;衍生化时间为20 - 40 min;缓冲盐的pH = 10。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加222;通过对小分子胺类药物的结构修饰,其衍生物非极性显著增大,保留时间显著延长,但是检测灵敏度未见提高。 在上述研究基础上,分别建立了KL-1(酚羟基)、丹皮酚(酮基)、L20051117(羧基)、伏格列波糖(醇羟基)和加巴喷丁(胺基)等各官能团代表药物在生物样品中的衍生化LC-MSn联用定量测定方法,在完成方法系统验证的基础上,对实际的生物样品进行检测。研究结果表明,各个衍生化反应定量测定方法经过系统验证,均可满足实际生物样品中药物的PK/PD研究。对于未经衍生化难于测定的药物,通过衍生化,或显著提高了检测灵敏度,或显著增加了保留时间,或降低基质抑制和杂质干扰,而且衍生化后,峰形都有所改善,信噪比提高。 另外,本文还应用新型的测定方法:HILIC-MSn实现对反相色谱难保留的胺基类药物的非衍生化方法的测定。以盐酸美金胺、加巴喷丁和盐酸特拉唑嗪为代表药物应用HILIC进行系统研究,结果表明,相比反相色谱,HILIC有以下三个优势:①在流动相中可以使用较高的有机相,有利于质谱检测灵敏度提高;②对极性化合物有很好的保留;③较低的基质抑制效应和杂质干扰。相比衍生化方法,可以避免前处理耗时长的问题。 总之,衍生化LC-MSn联用的方法对于测定一些LC-MSn难测定的药物是十分有效的方法,该方法可以从根本上解决一些药物稳定性差、色谱保留差、杂质干扰大和检测灵敏度不高等问题。本文所选的衍生化反应效率高、操作简单快速,重复性好。各官能团的衍生化反应经过系统验证,可以满足生物样品中药物的定量测定。本文在系统验证的基础上,进一步研究了这些代表药物在生物体内的药代动力学。