布鲁氏菌膜蛋白组学研究及免疫蛋白的筛选鉴定

【摘要】： 布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的动物源性传染病,在我国被列为二类传染病,主要引起人的波状热和慢性感染以及反刍动物的不育和流产。尽管布病是一种古老的传染病,但人们对它的认识还很肤浅,很多问题还没有得到解决,如布鲁氏菌的致病机制、细胞内的寄生机制、免疫机制,不同种宿主寄生的差异,以及布病的免疫预防问题等。随着细菌蛋白质组学的发展,通过研究分析细菌蛋白质的组成分布及功能,给揭示上述问题带来了福音。布鲁氏菌的膜蛋白具有促进对表面的黏附、转运溶质和营养进入细胞、输出蛋白和大分子、允许细胞间信号交换、感受外部环境的变化、保持膜的稳定和维持细胞内相对于外周环境的高渗透压等功能。利用蛋白质组学技术研究分析布鲁氏菌膜蛋白,比较不同种间膜蛋白的差异、筛选鉴定免疫原性蛋白,对于研究布鲁氏菌的生物学分类、不同种间的关系,解释不同种宿主寄生的差异,从而挖掘布鲁氏菌毒力、免疫相关分子,阐明致病机制与免疫机制,进一步研发新型疫苗均具有重要意义。 本研究用碳酸盐和新兼性离子去污剂方法成功地提取了布鲁氏菌的膜蛋白,进行2-DE分离,获得了很好的蛋白分离效果。在对布鲁氏菌不同种的强毒株544A和16M进行了比较蛋白质组学研究后发现,在pI 4.0～7.0,MW 6.5～100kDa的2-DE图谱中共发现130个差别表达的蛋白质点,液相串联质谱(LC-MS/MS)鉴定了31个蛋白点,获得23个ORF,经生物信息学分析,这些蛋白涉及能量转化生成、代谢相关酶、信号传导、细胞膜合成等。比较结果显示544A和16M虽同为布鲁氏菌的强毒株,但各自的膜蛋白表达显示其在宿主环境中的代谢机制有明显不同:1)两者通过不同的能量生成与转化功能蛋白表达上调,以供在恶劣的宿主细胞环境中逃逸生存,如544A的gabD、gltA、BruAb2_0325,16M的BMEI0386、BMEⅡ0394;2)通过氨基酸代谢途径544A有ureC在极酸环境的保护机制,16M有BMEⅠ1635在缺氮环境中的保护途径;3)在544A中发现甲基转移酶家族ubiG、假想ABC输送胞质糖结合蛋白、Omp31、过氧化氢环境中保护性酶ahpC、通用压力蛋白BruAb1_1942等蛋白上调,为其适应胞内生存环境提供了生存条件,其中ahpC、ureC为已知的布鲁氏菌毒力因子;在16M中上调的Dps已有研究证明其在16M、M5和Rev1不同的布鲁氏菌强弱毒株中表达差异显著,可能为潜在的毒力因子。4)另在两种菌中均发现有上调的假定蛋白,如544A的BruAb1_1052、BruAb2_0291,16M的BMEI1092,在其他发表的差异蛋白质组学文献中也发现了不同的假定蛋白,这些蛋白没有生物信息学的支持对其功能无法预测,但暗示着布鲁氏菌中有很大一部分假定蛋白在它的胞内生存中发挥着重要作用。因此对标准强毒株不同的致病分子机制进行深入研究,对于理解布鲁氏菌的致病机制有重要的价值。 本研究同时对544A的膜蛋白用布鲁氏菌临床阳性牛、羊血清进行了免疫蛋白质组学研究。在pI 4.0～7.0,MW 6.5～100kDa的2-DE窗口上,共发现19个共同具有免疫原性的蛋白点,通过LC-MS/MS质谱分析和Mascot检索,获得19个ORF。19个蛋白中验证了一部分已知的免疫原性蛋白,也新发现了一部分免疫原性蛋白的,如gltA、ubiG、fabA、gap等,其中ubiG、BruAb1_1617、dadA为本研究中544A和16M的表达差异蛋白,猜测是可引发免疫应答的毒力因子。优选了5个蛋白基因进行PCR引物设计和扩增,在544A、16M和各自疫苗株S19、M5中均有这5个免疫相关蛋白基因的扩增,高的种间同源性和免疫原性提示这些蛋白可用于诊断和多肽疫苗研究。