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慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血造血干细胞生物学活性及其临床应用前期研究

吴贻琛  
【摘要】:干细胞因其具有自我更新及多向转化的功能,已被广泛应用于细胞替代治疗、基因治疗及组织工程。肝衰竭是威胁人类生命的严重疾病,并发症多,病死率高,治疗仍是世界难题。干细胞治疗在肝衰竭领域的应用也越来越多地受到人们的关注。目的:研究慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血造血干细胞的生物学活性,及其促进肝损伤修复、改善肝功能的可能机制:进一步探讨机体内环境的改变对其功能的影响。方法:本研究自慢加急性(亚急性)肝衰竭患者及健康志愿者外周血分离CD34+细胞,通过观察细胞形态、记录细胞生长曲线、检测细胞周期及细胞凋亡情况,了解其生物学活性;通过ELISA检测细胞培养液中细胞因子HGF、MMP-9、TNF-α、 IL-6, RT-PCR检测细胞表面标志丙酮酸激酶M2 (PK-M2,未成熟肝细胞表面标志)、整联蛋白β1 (Integrin-β1,肝细胞发育过程中细胞表面标志),L型丙酮酸激酶同功酶(L-PK,成熟肝细胞表面标志)的表达,免疫荧光检测细胞表面标志Integrin-β1的表达,探究外周血CD34+细胞在肝病患者体内修复损伤肝脏的可能机制;采用含慢加急性(亚急性)肝衰竭患者血浆置换前后血清的培养基体外培养患者外周血CD34+细胞,通过比较两组细胞的生长曲线,及RT-PCR检测细胞表面标志PK-M2、Integrin-β1,L-PK的表达,免疫荧光检测细胞表面标志Integrin-β1的表达情况,了解血浆置换后机体内环境的改善对外周血CD34+细胞生物学活性的影响:将荧光染料CFSE标记的慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血单个核细胞经尾静脉移植入肝损伤小鼠体内,通过观察CFSE标记的外周血单个核细胞在小鼠体内的迁移、在受损肝组织的定植,比较肝损伤干细胞治疗组、肝损伤组及对照组小鼠不同时间点的肝组织病理改变,了解慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血单个核细胞归巢及修复受损肝脏的能力。结果:慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血CD34+细胞体外培养显示,其具有良好的生物性活性,细胞形态、增殖、凋亡等特性较健康人外周血CD34+细胞无明显差异;慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血CD34+细胞可分泌HGF、MMP-9、 TNF-α、IL-6等可促进肝细胞生长的细胞因子,细胞表面表达PK-M2和Integrin-β1,提示慢加急性(亚急性)肝衰竭时,外周血CD34+细胞可能通过分泌细胞因子、以及向肝细胞转化,促进肝损伤修复,改善肝功能。含血浆置换后血清培养组外周血CD34+细胞的增殖明显优于含血浆置换前血清培养组(p0.05),提示血浆置换有利于肝衰竭患者外周血CD34+细胞的增殖;含血浆置换前血清培养组与含血浆置换后血清培养组均能检测到PK-M2、Integrin-β1,未检测到L-PK,提示血浆置换对于外周血造血干细胞向肝细胞分化的能力并无明显影响。肝损伤小鼠尾静脉注射荧光染料CFSE标记的慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血单个核细胞,荧光显微镜下观察肝组织冰冻切片,可见荧光标记的单个核细胞能够迁移至受损肝组织,并定植于肝实质内;观察比较肝损伤干细胞治疗组、肝损伤组及正常对照组小鼠不同时间点的肝组织病理,可见肝损伤干细胞治疗组小鼠干细胞移植后1周,肝损伤明显改善,随着时间的延长,肝组织损伤逐渐修复,至第3周时已基本恢复正常。结论:本研究结果表明,慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血CD34+细胞具有良好的生物学活性,慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血CD34+细胞还可通过旁分泌作用以及向肝细胞转化的途径,促进肝损伤修复,改善肝功能;血浆置换对肝衰竭患者机体内环境的改善有利于维持外周血CD34+细胞的生物学活性,进而发挥其更新、迁移以及分化的功能,有助于提高干细胞移植治疗肝衰竭的疗效。慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血单个核细胞在肝损伤小鼠体内可向受损肝组织迁移、定植,进而修复受损肝脏。


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