CSE/H_2S在限制蛋氨酸摄入减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤中的作用及机制研究

【摘要】：研究背景和目的:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种以肺泡上皮和肺毛细血管内皮损伤、炎症反应、血管通透性增加、肺水肿和难治性缺氧为特征的常见临床重症疾病,脓毒症/革兰氏阴性杆菌感染是其最常见的病因之一。目前ALI/ARDS的临床治疗策略主要是呼吸支持、抗感染、补液和对症支持治疗。由于缺乏特效药,该疾病治疗效果欠佳,死亡率甚至高达40%。蛋氨酸限制(Methionine restriction,MR)是一种已经被证实的确切有效的营养干预手段,能为从酵母菌到哺乳动物等诸多物种带来不同益处。在酵母、果蝇、蠕虫和鱼类等物种中,MR的主要益处是延长寿命;在哺乳动物中,MR可以增强应激抵抗力,改善代谢健康,延缓功能丧失,减少糖尿病、心血管疾病、癌症等重大疾病的发病率或改善其预后。MR发挥保护作用的相关机制较为复杂,可能与诱导自噬、减少线粒体中活性氧系(reactive oxygen species,ROS)和增加硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)从而降低氧化应激水平有关。其中,H_2S是在炎症,凋亡,血管调节等多个病理生理过程都能发挥重要保护效应的气体递质。MR的既往研究领域主要集中在慢性疾病或衰老相关性疾病。然而最近的研究表明MR还可以改善缺血/再灌注损伤,肾损伤和肠炎等急性疾病的病理表现。根据我们查阅文献的结果,目前尚没有关于MR对肺部疾病影响的研究。基于此,本研究拟探索MR对LPS诱导的小鼠ALI的影响,并探讨相关机制。研究方法:1.构建小鼠ALI模型分别采用吸入式气管滴注法和非暴露冷光源气管滴注法给予亚甲蓝溶液,10分钟后取出肺组织观察亚甲蓝染色情况。根据染色范围、染色均匀程度选择较为理想的给药方式,并用该方式给予LPS建立小鼠ALI模型,1、3、7天后取肺组织进行病理组织切片HE染色,确定该模型下小鼠肺组织损伤最重的时间点。2.MR对LPS诱导的小鼠ALI的影响小鼠给予LPS前7天开始喂养MR饮食直至取材时间,记录小鼠每天的体重;通过病理切片HE染色观察不同饮食组肺组织损伤变化情况;采用免疫组化染色观察肺泡上皮细胞损伤,炎症反应以及炎症通路TLR4/NF-κB/NLRP3激活情况;采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测肺泡灌洗液中IL-1,IL-6,TNF-α的改变;观察给予致死剂量的LPS后小鼠的生存率情况。3.MR对H_2S水平以及产生H_2S的相关酶类的影响采用比色法检测小鼠肺组织和循环中H_2S水平的变化;通过免疫组化染色观察肺部产生H_2S的相关酶类的蛋白水平变化,并用q RT-PCR检测其基因表达的改变。4.胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine-gamma-lyase,CSE)/H_2S在MR肺保护中的作用采用CSE特异性抑制剂炔丙基甘氨酸(propargylglycine,PAG)以及CSE基因敲除的方法观察抑制CSE后MR对ALI小鼠的肺保护作用的变化;采用比色法检测抑制CSE后小鼠肺部和循环中H_2S水平的改变情况。5.外源性H_2S对CSE基因敲除小鼠ALI的影响通过肺组织病理切片HE染色观察不同处理组损伤变化情况;采用免疫组化染色观察肺泡上皮细胞损伤,炎症细胞浸润以及炎症通路TLR4/NF-κB/NLRP3激活情况。研究结果:1.吸入式气管滴注法给予亚甲蓝后小鼠肺组织染色范围更广,更为均匀。采用该方法建立的小鼠ALI模型在给予15mg/kg的LPS后3天炎症细胞浸润,肺不张,出血,水肿最严重。2.MR可以减轻给予LPS后3天小鼠肺组织的水肿,出血,肺不张和炎症细胞浸润,同时小鼠体重与正常饮食组相比没有降低。3.MR降低了给予致死剂量LPS后7天内的小鼠死亡率。4.MR减轻了LPS导致的肺泡上皮细胞损伤以及巨噬细胞和中性粒细胞浸润,抑制了炎症通路TLR4/NF-κB/NLRP3激活,降低了肺泡灌洗液中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平。5.MR显著增加了肺部CSE的蛋白和基因表达量,同时增加了小鼠肺部和循环中的H_2S水平,而对胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST)表达无显著影响。6.CSE特异性抑制剂PAG以及CSE基因敲除消除了MR对LPS诱导的ALI的保护作用,同时也逆转了由MR引起的肺部和循环中H_2S水平的增加。7.给予外源性H_2S可恢复MR对CSE基因敲除小鼠的保护作用,包括减轻肺组织水肿,出血,肺不张,炎症细胞浸润和肺泡上皮细胞损伤,抑制炎症通路TLR4/NF-κB/NLRP3激活。研究结论:1.与非暴露冷光源气管滴注法相比,吸入式气管滴注法构建小鼠ALI模型操作更简单,成功率更高,效果更稳定,是更理想的建模方法。通过该方法给予15mg/kg的LPS后3天肺组织损伤最严重。2.MR能够改善LPS诱导的肺不张,水肿,出血和炎症因子释放,减少巨噬细胞及中性粒细胞浸润,减轻肺泡上皮细胞损伤,降低小鼠死亡率,并且不会引起小鼠营养不良。3.MR通过上调CSE/H_2S减轻小鼠ALI,该作用与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路激活有关。