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1、胎盘中11β-HSD2在子痫前期中作用的研究 2、H_2S对红细胞携氧功能的调控作用机制

王钢  
【摘要】:本论文第一部分主要围绕11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用进行研究。子痫前期是妊娠期特有的疾病,严重影响着母体和胎儿的健康,是导致孕产妇和胎儿发病死亡的主要原因之一。目前,针对子痫前期并没有有效的诊断和治疗措施,临床上最有效的治疗方法仍然是提前终止妊娠。胎盘被认为在子痫前期发病过程中起着至关重要的作用,因为随着胎盘的娩出,子痫前期的相关症状也会随之消失。但是,胎盘是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未完全阐明。近年来,子痫前期二元发病理论被广泛接受,即在子痫前期发病机制的第一阶段,由于胎盘发育不良滋养层细胞侵入能力受损,使胎盘滋养层细胞无法侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉,从而子宫螺旋动脉无法从高阻力,低容量的血管转变为低阻力,高容量的血管。由于子宫螺旋动脉重构障碍,胎盘无法得到充足的氧气和血液供应致使胎盘处于缺血缺氧的不良状态。之后,在子痫前期发病机制的第二阶段,胎盘处于缺氧缺血的状态下会释放大量有害的细胞因子进入到母体循环中,造成母体广泛的内皮功能紊乱,继而造成母体出现高血压,蛋白尿等症状。糖皮质激素在妊娠期间很多过程如胚胎着床,胎盘胎儿的生长发育以及胎儿的分娩中都发挥着重要的调节作用。糖皮质激素可以作用到胎盘、胎儿、胎膜等妊娠期组织。随着妊娠期的进行,母体和胎儿血液循环中的糖皮质激素水平都会随之升高,但母体循环中的糖皮质激素升高水平是胎儿侧的数倍。如果胎儿暴露在母体过量的糖皮质激素水平之下,会导致胎儿生长发育不良。胎盘中的11β-HSD2可以将有活性的糖皮质激素转变为无活性的糖皮质激素,从而可以阻止母体过量的糖皮质激素进入胎儿循环中。有研究显示,子痫前期产妇胎盘中的11β-HSD2表达是降低的,糖皮质激素水平是升高的。也有研究发现,妊娠期SD大鼠皮下注射地塞米松会导致大鼠出现高血压,蛋白尿等子痫前期相关症状。这些研究提示我们11β-HSD2可能参与到子痫前期的发病机制当中,但是11β-HSD2是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未阐明。由于子痫前期二元发病理论被广泛认可,那么,胎盘中11β-HSD2表达异常是否是通过抑制胎盘滋养层细胞侵入功能和促进胎盘释放有害细胞因子进入母体等过程参与到子痫前期发病过程中呢?因此,为了探究11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用,我们分别在整体动物和离体细胞水平上,进行了相关实验探索。主要实验结果如下:1、妊娠期间抑制11β-HSD2活性可以导致大鼠产生子痫前期相关症状。我们在大鼠妊娠期间(GD7.5-19.5)皮下注射11β-HSD2抑制剂CBX 180μg/d、360μg/d、720μg/d,3种剂量观察抑制11β-HSD2之后是否会直接导致大鼠出现子痫前期的相关症状。结果显示:(1)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组胎盘中11β-HSD2蛋白表达减少并且活性受到抑制。(2)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。2、胎盘特异性抑制11β-HSD2活性导致妊娠期大鼠产生子痫前期相关症状。由于胎盘在子痫前期的发病过程中起着至关重要的作用,我们建立了胎盘特异性抑制11β-HSD2活性的妊娠期大鼠模型。动物实验分为五组:空白对照组(CON)、CBX180μg/2d、CBX-NPs、CBX-SRC、CBX-CSA。从GD7.5开始尾静脉给药处理,每两天1次持续到GD19.5。结果显示:(1)只有带有胎盘靶向多肽标签的CBX-CSA组大鼠胎盘中11β-HSD2的蛋白表达和酶活性是减少的。(2)胎盘特异性抑制11β-HSD2之后妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。3、妊娠期(GD7.5-19.5)皮下注射地塞米松(DEX)导致大鼠产生高血压、蛋白尿、肾损害等子痫前期相关症状。4、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以抑制胎盘滋养层细胞的侵入。PAS、α-actin、CK免疫组化染色结果显示,360μg/d和720μg/d两组全身给药动物模型和CBX-CSA组靶向给药动物模型胎盘中,滋养层细胞侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉功能受损。5、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以导致子宫胎盘血流灌注不足。多普勒超声结果显示,全身给药模型中360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠中子宫螺旋动脉,胎盘中母体通道,胎儿侧脐动脉内血流速度均受到抑制。同时,胎盘特异性给药模型中CBX-CSA组妊娠期大鼠子宫螺旋动脉,胎盘中母体通道,胎儿侧脐动脉内血流速度也均受到抑制。6、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以导致母体循环中血管生成因子与抗血管生成因子水平失衡。结果显示,全身皮下给药模型中360μg/d和720μg/d两组血清中PIGF的表达水平并没有变化,但是sFlt1水平较其他组明显升高。同时,胎盘特异性给药模型中,五组动物模型的血清中PIGF的表达水平并没有变化,但是CBX-CSA组血清中的sFlt1水平较其他四组明显升高。7、11β-HSD2可以调节早期胎盘滋养层细胞系HTR8-S/Vneo迁移和侵入的能力。结果显示:(1)Cortisol(10~(-9)-10~(-6)M)梯度处理之后对HTR8-S/Vneo细胞迁移和侵入能力并没有影响。(2)11β-HSD2 siRNA联合cortisol(10~(-6)M)处理之后可以抑制HTR8-S/Vneo细胞的迁移和侵入能力。8、11β-HSD2可以调节原代胎盘滋养层细胞PIGF和sFlt1的释放。结果显示,单独11β-HSD2 siRNA处理滋养层细胞之后并不能够导致sFlt1释放增加。但是,联合cortisol(10~(-6)M)处理之后可以明显导致sFlt1的释放增加。然而,11β-HSD2 siRNA联合cortisol(10~(-6)M)处理并没有导致PIGF的释放改变。9、11β-HSD2可以调节原代胎盘滋养层细胞ADAM17蛋白表达。体外培养原代胎盘滋养层细胞在cortisol(10~(-9)-10~(-6)M)和CBX(10~(-6)-10~(-5)M)联合处理之后,western blotting方法检测滋养层细胞中ADAM10/17的蛋白表达水平是否发生变化。结果显示,ADAM10蛋白表达水平并没有升高,但是ADAM17的蛋白表达水平在cortisol(10~(-9)-10~(-6)M)和CBX(10~(-6)-10~(-5)M)联合处理之后明显升高。10、原代胎盘滋养层细胞转染ADAM17 siRNA处理之后,Elisa检测培养细胞的上清,结果显示,敲低ADAM17表达之后上清sFlt1的水平也随之下降。11、ADAM17启动子序列克隆在带有荧光素酶报告基因的质粒上转染原代滋养层细胞,应用地塞米松处理。结果显示,地塞米松能够上调带有ADAM17启动子质粒的荧光强度。12、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以上调胎盘中ADAM17的表达。(1)Western blotting结果显示,在两种动物模型中,360μg/d和720μg/d两组以及CBX-CSA组的胎盘中ADAM17的蛋白表达水平是增加的。(2)Western blotting结果显示,11β-HSD2在子痫前期产妇胎盘中的表达是明显下调的。同时,ADAM17在子痫前期产妇胎盘中的表达是明显上调的。结论:动物模型和离体细胞实验结果都表明,胎盘中11β-HSD2表达异常可以导致胎盘滋养层细胞侵入功能受损和血管生成因子与抗血管生成因子表达失衡,进而参与到子痫前期的发生发展当中。本论文第二部分主要围绕H_2S对红细胞携氧功能的调节作用进行研究。H_2S是继NO、CO之后被发现的第三类气体信号分子,可以参与调节人体很多生理和病理过程。H_2S可以参与调节血管舒张,血管形成,炎症反应以及氧化应激等过程。机体是在L-半胱氨酸的相关代谢通路中产生H_2S,其介导H_2S产生的两种酶分别是胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)。CSE和CBS两种酶可以将同型半胱氨酸和胱硫脒代谢产生L-半胱氨酸,在产生L-半胱氨酸的过程中会伴随着H_2S的释放。CSE与CBS两种酶在人体心血管系统,呼吸系统,神经系统之中广泛表达。有研究显示,在缺氧应激的环境下,机体很多组织和细胞如脑、肺、内皮细胞、心肌细胞等都会出现H_2S生成减少的现象。我们课题组前期的研究也显示,胎盘在缺氧的状态下,CBS和CSE的蛋白表达降低,H_2S的生成也随之减少。红细胞是人体血液中最常见的细胞,其主要的生理功能是负责氧气的运输。红细胞可以在肺脏中结合氧气使细胞内血红蛋白转变为氧合血红蛋白,之后红细胞随血液流经外周组织将血红蛋白携带的氧气释放到外周组织之中。氧气与血红蛋白的亲和性和氧分压的关系可以用氧离曲线表示。氧气与血红蛋白结合为50%时的氧分压称之为P50,其可以反应血红蛋白与氧气的亲和能力。血红蛋白与氧气的结合和释放受到很多因素如pH、温度、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-BPG)的调节。2,3-BPG可以变构调节血红蛋白的构象,使其与氧气亲和性降低,利于氧气的释放。2,3-BPG是通过红细胞内糖酵解通路产生的1,3-BPG在2,3-二磷酸甘油酸变构酶(bisphosphoglycerate mutase,BPGM)的作用下生成的。2,3-BPG可以被2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶降解,但是由于磷酸酶的活性较低,因此2,3-BPG在红细胞内蓄积并发挥作用。有研究显示,人体在缺氧的环境下,红细胞内的2,3-BPG表达升高,使血液在流经外周组织时释放更多的氧气。也有研究显示,人体在高海拔缺氧的环境下,随着缺氧时间的增加,血清中H_2S的水平也随之减少。那么,H_2S是否可以调节红细胞中2,3-BPG的表达进而调节红细胞的携氧功能呢?为了解决上述问题,我们设计了相关实验。主要实验结果如下:1、我们首先建立了Cse~(-/-)基因敲除小鼠模型,之后收集野生型小鼠和Cse~(-/-)小鼠的红细胞进行代谢组学的分析,结果显示,两组红细胞有30种差异代谢物,其中Cse~(-/-)小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。代谢组的结果提示我们,H_2S的减少可以导致红细胞中2,3-BPG表达升高。2、为了进一步验证H_2S对红细胞携氧功能的调节,我们采用2,3-BPG检测试剂盒检测红细胞中2,3-BPG水平,结果与代谢组分析一致,Cse~(-/-)小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。之后,我们外源性的注射H_2S供体GYY4137之后可以逆转这一现象。同时,我们通过血气分析检测了红细胞的携氧功能指标氧离曲线和P50。结果显示,H_2S减少同样会导致红细胞氧离曲线右移和P50升高。GYY4317处理Cse~(-/-)小鼠之后可以逆转这一现象。3、为了探究血清中H_2S的来源,我们建立了Cse~(-/-)基因敲除小鼠与野生型小鼠骨髓移植模型,分为3组:野生型小鼠骨髓移植到野生型小鼠(WT-WT),野生型小鼠骨髓移植到Cse~(-/-)小鼠(WT-Cse~(-/-))以及Cse~(-/-)小鼠骨髓移植到野生型小鼠(Cse~(-/-)-WT)。结果显示,红细胞本身H_2S的减少不会导致血清中H_2S的改变,然而,外周组织H_2S的减少会影响血清中的H_2S水平。同时,红细胞携氧能力检测显示,外周组织H_2S减少会导致红细胞2,3-BPG以及P50升高。GYY4317处理WT-Cse~(-/-)组小鼠之后,可以逆转2,3-BPG以及P50的升高。4、为了探究H_2S对红细胞的直接作用,我们离体培养了人和小鼠的红细胞,应用GYY4137(250μM,500μM)处理之后,检测红细胞携氧功能,结果显示,H_2S可以抑制红细胞2,3-BPG和P50的水平并导致氧离曲线左移。5、为了探究H_2S是通过何种机制调节2,3-BPG的水平,我们在整体动物模型和离体细胞水平检测了红细胞中BPGM酶活性的变化,结果显示,Cse~(-/-)基因敲除小鼠红细胞中BPGM的酶活性升高,GYY4137注射处理之后可以逆转这一现象。人和小鼠离体细胞GYY4137处理之后,同样可以抑制红细胞中BPGM的酶活性。结论:H_2S通过影响红细胞中BPGM的活性进而改变2,3-BPG的表达导致红细胞携氧功能的改变。


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