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HBx基因EHBH2基因型影响肝硬化和肝癌进程的分子机制及临床意义研究

徐庆国  
【摘要】:乙型肝炎病毒感染(HBV)是全球范围内的主要公共健康问题之一,尤其是包括我国在内的发展中国家。虽然目前针对HBV的抗病毒治疗可以抑制HBV的复制,但仍不能彻底清除HBV。部分慢性乙型肝炎(CHB)患者发展成为进行性肝纤维化,并逐步导致了肝硬化,甚至是原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生。在我国,由于HBV感染的广泛性和抗病毒治疗的不规范性使得肝硬化和肝癌的发生比例较高。慢性HBV感染所导致的肝硬化和肝癌严重威胁着我国人民的生命健康,是我国十三五规划中需要着重解决的重大课题。HBV X基因(HBx)作为HBV四个开放阅读框之一,可以编码出分子量为17KD的HBx蛋白。大量的研究证实HBx蛋白在肝硬化和肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用,是尤为重要的病毒蛋白。由于HBV复制过程中不准确的逆转录和缺乏校对能力,HBx DNA存在多种变异。在前期研究中,我们通过测序技术在大队列的肝癌癌组织和癌旁组织中对HBx的基因型进行了调查,发现了一型携带多个位点共同变异的基因型,即HBx-EHBH2(HBx-E2)。预后分析表明携带HBx-E2的患者预后较好。此外,我们还初步研究了HBx-E2在肝癌细胞中的生物学功能。然而,HBx-E2在判断肝癌患者预后中的作用和在临床转化中的意义还需多中心的队列进行验证,而且HBx-E2在肝癌发生和发展中所发挥的功能,以及具体的分子机制仍需进一步探索。同时,HBx-E2与临床病理指标的相关性分析表明HBx-E2与肝硬化的缺失相关。所以,HBx-E2在肝硬化进程中是否也发挥了与其他基因型不同的作用,也需我们进一步研究。针对上述的科学问题,我们开展了本研究。第一部分 HBx基因EHBH2基因型影响肝癌进程的分子机制研究目的:明确HBx-E2基因型在术前预测肝癌患者预后中的作用。确定HBxE2在肝癌发生发展中的生物学功能及相关分子机制。研究方法:在不同地区的肝癌患者队列中检测HBx基因型,并对HBx-E2进行预后分析和临床病理指标相关性分析。构建多株表达多个HBx基因型的肝癌细胞系和肝细胞系,通过细胞计数试剂盒8(CCK8)、克隆形成、流式细胞术等实验明确HBxE2对细胞增殖的影响。利用体外合成重组HBx蛋白和蛋白芯片筛选HBx-E2与野生型HBx蛋白结合蛋白的差异,并通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术探索分子机制。研究结果:在不同地区的肝癌患者组织队列(n=171)的癌和癌旁中以及在血清队列(n=168)中,HBx-E2均与患者较好的预后相关。临床病理指标相关性分析表明HBx-E2与肝硬化缺失、肿瘤直径较小相关。按照HBx基因型分类和巴塞罗那肝癌临床(BCLC)分期在组织队列和血清队列分层进行预后分析,结果表明HBx-E2可以作为术前预测BCLC B期患者预后的分子标记物。体内外实验证明相对于其他基因型,HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力。蛋白芯片和免疫共沉淀等实验发现HBx-E2失去与JAK1结合的能力,而且不能激活STAT3和STAT5。JAK1的抑制剂Upadacitinib可以抑制除HBx-E2外其他基因型的增殖能力。研究结论:HBx-E2可以作为分子标记物术前预测BCLC B期患者预后。HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力,不能激活JAK1/STATs通路。JAK1是HBV相关肝癌中某些HBx基因型患者的潜在治疗靶点。第二部分 HBx基因EHBH2基因型在肝硬化中的作用及分子机制研究目的:HBx可以通过促进肝细胞分泌细胞因子,以旁分泌的形式促进肝星状细胞(HSCs)的激活,从而推进肝硬化的进展。本部分研究主要是通过明确表达各种HBx基因型的肝细胞对HSCs激活的影响,探索HBx-E2基因型在HBV相关肝硬化进展过程中的作用及相关分子机制。研究方法:通过表达各HBx基因型肝细胞的培养上清刺激HSCs,利用实时定量PCR、western blot和免疫荧光的技术检测HSCs的激活情况。ELISA实验检测表达各HBx基因型肝细胞培养上清中细胞因子的差异,明确导致HSCs激活差异的细胞因子。通过添加中和性抗体、重组细胞因子、相关受体抑制剂进一步证明目标因子对HSCs激活的作用。利用western blot等技术明确各HBx基因型对目标因子的调控作用。研究结果:携带HBx-E2基因型的肝癌患者癌旁组织的肝硬化程度明显低于携带其他基因型的患者。表达HBx-E2基因型的肝细胞激活HSCs的能力明显弱于表达其他基因型的肝细胞,而且其促进HSCs增殖和迁移的能力也明显弱于表达其他基因型的肝细胞。表达各HBx基因型的肝细胞对HSCs激活的差异是因为分泌VEGF不同所导致的。VEGF受体抑制剂Fruquintinib可以消除各HBx基因型肝细胞对HSCs激活的差异。针对不同的HBx基因型,单独应用TGF-β受体抑制剂A83-01,或联合应用Fruquintinib可以抑制HBx激活HSCs的作用。抑制其他基因型肝细胞中p-STAT3的激活,可以抑制VEGF的分泌。研究结论:HBx-E2由于不能激活JAK1/STAT3通路从而失去了促进VEGF分泌的作用,导致表达HBx-E2基因型的肝细胞激活HSCs的能力明显弱于其他基因型。TGF-β受体抑制剂和VEGF受体抑制剂可以作为阻断肝纤维化和肝硬化进展的潜在临床靶向药物。


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1 徐庆国;HBx基因EHBH2基因型影响肝硬化和肝癌进程的分子机制及临床意义研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2018年
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