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AGTR1对肝癌细胞生物学特性影响及其靶向治疗作用的实验研究

鲍蕾蕾  
【摘要】:近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,现已成为我国第二世界第三位的癌症死亡原因。我国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%~20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间我国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs)和血管紧张素受体抑制剂(angotensin recepter blockers,ARBs)的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R(type-1 angiotensin II)其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。我们对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。第一部分AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中我们对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,我们筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。第二部分:AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,我们采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,我们先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC-7721,BEL-7404细胞过表达AGTR1,两个细胞内VEGF的表达也随着AGTR1的表达上升而上升。对高表达AGTR1的MHCC-97H细胞干扰表达AGTR1,VEGF的表达也随之下降,且因AGTR1的高表达或过表达引起的VEGFA的上调表达可以被AG490抑制。由此我们可以推断,AGTR1的高表达可能会促进细胞内JKA2的磷酸化,进而激活细胞质内STAT3、ERK等分子的磷酸化,这些磷酸化的分子可进入细胞核,启动VEGF等分子的转录、翻译、合成,促进细胞分泌VEGF等细胞因子,大量新分泌的VEGF与细胞表面的受体结合可能会进一步激活细胞内STAT3、MAPK等信号通路,促进肿瘤内新生血管的生成及细胞的增殖、迁移等生物学过程。第三部分:AGTR1抑制剂对HCC细胞体内外抗肿瘤作用效果研究本部分研究中我们选择临床应用时间最长、应用病例最多的洛沙坦作为靶向AGTR1的抑制剂考察其作用效果。在体外实验中,我们发现当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高表达的MHCC-97H细胞和AGTR1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,但对AGTR1低表达的SMMC-7721细胞和AGTR1干扰表达的MHCC-97H细胞则无上述作用。体内实验中,我们选用高表达AGTR1的MHCC-97H细胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药,相比空白对照组,20mg·Kg~(-1)~80 mg·Kg~(-1)给药剂量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。免疫组化分析发现随着给药剂量的增加,瘤内AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表达水平显著下降,血清VEGFA量也随着洛沙坦的给药剂量提高而受到不同程度的抑制。由此我们考察了洛沙坦在体内外水平对AGTR1高表达HCC细胞生长及肿瘤血管形成的抑制作用。综上所述,本课题通过TCGA数据库中全部肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据,对AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用,在此基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。对6种不同的肝细胞癌细胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)与正常肝细胞系(QSG-7701)进行AGTR1的mRNA及蛋白的表达检测,证实相比正常肝细胞系(QSG-7701),肝细胞癌细胞系MHCC97H、HLF中AGTR1 mRNA和蛋白水平均有显著的上调表达,而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1 mRNA和蛋白水平的表达显著低于正常肝细胞的表达水平。通过验证临床肝癌样本中AGTR1的表达情况,显示33例肝细胞癌样本中有20例临床样本AGTR1呈上调表达或高表达。进一步通过体内外实验,发现过表达AGTR1后可促进HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,加速裸鼠皮下肿瘤形成及生长;而抑制AGTR1的表达可降低HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,并降低HCC肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。通过对AGTR1相关通路的分析,揭示AGTR1高/过表达HCC细胞主要通过JAK2/STAT3通路介导其生长、增殖、迁移及侵袭过程,同时验证了AGTR1靶向抑制剂的作用。在药效实验中,探讨以AGTR1靶向抑制剂洛沙坦对HCC细胞的作用效果,结果发现在体外试验中,当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高/过表达HCC细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。在体内实验的裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药(20mg·Kg~(-1)~80 mg·Kg~(-1)),洛沙坦能显著抑制AGTR1高表达HCC细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,降低肿瘤组织中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表达。由此我们证明了洛沙坦在体内外水平具有抑制AGTR1高表达HCC细胞生长的作用。研究结果明确了AGTR1在肝癌发生发展中的作用,探讨了AGTR1促进肝细胞癌细胞异常生长的可能机制,为AGTR1高表达肝细胞癌靶向治疗药物的发现及应用提供了实验数据。


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