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人乳牙牙髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病大鼠疗效观察与机制探讨

许忆峰  
【摘要】:糖尿病是一组由多种原因导致胰岛素分泌缺陷和(或)生物学作用障碍,以高血糖和(或)微血管与大血管病变为主要特征的代谢性疾病,其中2型糖尿病是以胰岛素抵抗为主和(或)伴有胰岛素分泌的缺陷,是糖尿病的主要类型,其病因复杂,不易控制且难以治愈。干细胞是机体各种组织细胞的初始来源,其最显著的生物学特征是可以自我更新及多向分化,人脱落乳牙牙髓干细胞的表型为间充质干细胞,具有广泛的来源,具备原始细胞的增殖与分化能力,同时具有旁分泌多种细胞因子的功能,免疫原性低,无伦理争议,在体内可通过化学趋化性引导其“归巢”,可能会通过多种途径减少胰岛?细胞凋亡、促进胰岛?细胞的增殖与转分化,增强胰岛功能及改善胰岛素抵抗,有可能会成为治疗2型糖尿病的种子细胞。高压氧治疗能够改善组织局部供氧、促进新陈代谢,可能还有调节免疫的作用,故而可能与干细胞治疗有协同作用。本课题对2型糖尿病大鼠进行了乳牙牙髓干细胞联合高压氧治疗的研究,以期能为人脱落乳牙牙髓干细胞治疗2型糖尿病的临床应用提供理论依据。[目的]研究人脱落乳牙牙髓干细胞联合高压氧治疗是否对2型糖尿病大鼠具有治疗作用,并探讨其可能的作用机制。[方法]4周龄的SD大鼠适应性喂养1周后,予高脂饲料喂养8周,再予腹腔注射30mg/kg的链脲佐菌素(STZ),构建2型糖尿病大鼠模型。建模成功后,糖尿病大鼠随机分为干细胞治疗组、高压氧治疗组、干细胞联合高压氧治疗组、糖尿病对照组,同时设立正常大鼠对照组。每周记录大鼠的进食量、体重和血糖;大鼠高脂喂养前及喂养8周后、2型糖尿病大鼠治疗前及治疗干预2、4及6周后分别行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),评估血糖和胰岛素释放功能,计算血糖与胰岛素曲线下面积(AUC_(0-120min))及稳态模式评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);每次均留标本检测血脂、24小时尿蛋白、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)与白介素6(IL-6)等指标。治疗6周后处死大鼠,分别用光镜观察胰腺、肺、肝及肾脏形态学变化,电镜观察胰岛?细胞组织形态学改变,用免疫组化及免疫荧光染色方法观察大鼠胰岛等组织中胰岛素和胰高糖素的表达情况,使用Image-Pro Plus 6.0软件计算胰岛组织免疫组化染色中胰岛素与胰高糖素的染色强度,行胰岛细胞TUNEL凋亡染色及Ki67/PCNA增殖染色并计算凋亡指数与增殖指数,实时定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测胰腺组织Pdx1、Ngn3、Pax4 mRNA的表达情况。数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析,比较各组间的治疗情况。[结果]1、与正常对照组相比,高脂喂养8周后,高脂饲料组大鼠的血糖、HOMA-IR指数、血清甘油三脂(TG)与胆固醇(TC)、血清TNF-α与IL-6均升高,体重明显增加(均p0.05),24小时尿蛋白无明显差异(p0.05);2、与糖尿病对照组相比,干细胞联合高压氧治疗组大鼠在干预治疗2周后血糖AUC_(0-120min)值、血清TNF-α与IL-6降低;3周后体重增加、空腹血糖降低;4周后HOMA-IR指数、血清TG、24小时尿蛋白均降低,胰岛素AUC_(0-120min)值升高;6周后血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)降低(均p0.05);3、与糖尿病对照组相比,干细胞治疗组大鼠在干预治疗2周后血清TNF-α降低,4周后空腹血糖、血糖AUC_(0-120min)值、HOMA-IR指数、血清TG、24小时尿蛋白水平、血清IL-6均降低,胰岛素AUC_(0-120min)值升高;6周后体重增加、血清LDL-C降低(均p0.05);4、与糖尿病对照组相比,高压氧治疗组大鼠在干预治疗4周后血清TG、血清TNF-α降低,6周后血清LDL-C、24小时尿蛋白降低(均p0.05);5、与糖尿病对照组相比,干预治疗6周后,干细胞联合高压氧治疗组与干细胞治疗组胰腺中胰岛数量增加、形态好转、炎症减轻;免疫组化及免疫荧光显示,干细胞联合高压氧治疗组与干细胞治疗组胰岛中胰岛素阳性细胞(?细胞)增加、胰高糖素阳性细胞(α细胞)减少(均p0.05);联合治疗组与干细胞治疗组的肾小球与肾小管间质中发现有少量胰岛素阳性细胞;联合治疗组与干细胞治疗组的肝肺肾组织形态有好转、炎症减轻。6、与糖尿病对照组相比,治疗6周后联合治疗组与干细胞治疗组胰岛细胞TUNEL凋亡指数均明显降低、Ki67与PCNA增殖指数均明显升高(均p0.01);联合治疗组指数水平优于干细胞治疗组与高压氧治疗组(均p0.01)。7、与糖尿病对照组相比,治疗6周后联合治疗组与干细胞治疗组胰腺组织Pdx1、Ngn3、Pax4 mRNA的表达水平均明显增加(均p0.01);联合治疗组表达水平高于干细胞治疗组与高压氧治疗组(均p0.01)。[结论]人脱落乳牙牙髓干细胞联合高压氧治疗能降低2型糖尿病大鼠的血糖、升高胰岛素水平、改善胰岛素抵抗,还能降低血TG与LDL-C水平、减少24小时尿蛋白量。其升高胰岛素可能是通过增加胰腺Pdx1、Pax4、Ngn3基因mRNA的表达,从而诱导胰腺?细胞分化与转分化、促进其增殖,同时减少局部炎症反应及?细胞凋亡来实现的;部分干细胞有可能定位于胰腺与肾脏直接分化为胰岛素分泌细胞;改善胰岛素抵抗可能是通过调节免疫降低了促炎症细胞因子TNF-α与IL-6,从而减少机体的炎症反应来实现的;血脂与尿蛋白的改变可能与血糖、胰岛素抵抗及炎症状态的改善相关。干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病大鼠较单独干细胞治疗起效快,疗效优于单独高压氧治疗,提示联合治疗对疗效有协同作用。


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