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CD47通过mTORC1调控氧化还原状态促进肝细胞癌生长

马韵涵  
【摘要】:【研究背景及目的】肝癌在全球癌症相关死亡最常见原因中排第二。原发性肝癌最主要的形式是肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)。急需鉴定出新的可用于早期诊断和治疗的分子靶点。CD47(Cluster of Differentiation 47)是一种五次跨膜的糖蛋白,其广泛表达于正常组织中。在正常细胞中通过与巨噬细胞上的信号调节蛋白α相互作用抑制巨噬细胞的吞噬从而产生自我保护信号。CD47在心血管功能稳定、免疫调控、细胞和组织抵抗应激和包括肿瘤在内的多种慢性疾病中发挥病理生理功能。在多种骨髓瘤、淋巴瘤、白血病和实体肿瘤中的乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤以及肝细胞癌中CD47呈现高水平。CD47在肝细胞癌肿瘤起始细胞中呈现高表达,对肿瘤的起始、自我更新和转移发挥促进作用,并显著影响患者的临床预后。NF-κB信号通路可介导CD47表达水平的升高进而促进肝细胞癌对索拉菲尼的化疗抵抗,抗CD47的抗体联合索拉菲尼成为有前景的治疗方案。mTOR蛋白是一种广泛表达的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶,属于PI3K相关的激酶家族成员。它可作为细胞能量的感受器,通过整合来自激素、能量水平、生长因子和营养物质的多种信号进而调节蛋白转录、自噬和脂代谢。mTOR调控细胞功能是通过在结构和功能上各异的两个复合体mTORC1和mTORC2来实现的。其中,mTORC1复合体由mTOR、mTOR调节相关蛋白(RAPTOR)、哺乳动物致死性SEC13蛋白8(mLST8)、富含脯氨酸的Akt底物40(PRAS40)和包含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEPTOR)组成。mTORC1复合体可被氨基酸、生长因子和营养物质所激活,且它的活化可引起蛋白合成和脂质合成的增加和自噬水平的降低进而促进细胞存活。除此之外,mTORC1可增加细胞内Nrf2的蛋白水平。红细胞衍生核因子2样蛋白2(NFE2L2)又称为Nrf2,是细胞内重要的转录因子,可调控抗氧化基因的表达从而保护细胞抵抗氧化应激。mTORC1通过磷酸化p62/SQSTM1的351位丝氨酸位点,促进其与Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)的结合进而减少Keap1介导的Nrf2的降解从而稳定Nrf2的表达。本研究发现CD47可通过调控mTORC1促进肝癌的生长并帮助肝癌细胞抵抗氧化应激。本研究旨在探索CD47分子在肝细胞癌中的非免疫学的病理生理功能以期加深对其功能的了解,并对相关机制进行探索,为CD47作为肝癌诊断和治疗的靶点打下基础。【研究方法】1、应用慢病毒方法建立差异表达CD47肝细胞癌细胞系,包括CD47过表达、干扰以及对照细胞。2、应用CCK-8(cell count kit-8)法测定差异表达CD47肝癌细胞2D增殖情况。应用soft agar、Matrigel和低黏附成球实验研究差异表达CD47肝癌细胞在不同的3D培养条件下的生长情况。3、应用Western blot技术检测不同处理条件下相关信号通路中各组细胞蛋白质及其磷酸化水平的变化情况。4、应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测抗氧化相关基因等基因的表达情况。5、应用流式细胞术分析细胞CD47、SLC3A2分子的表达情况,联合活性氧探针检测不同条件下细胞内活性氧水平。联合Annexin V/PI凋亡检测试剂盒检测H_2O_2处理下细胞的凋亡水平。6、应用氨基酸质谱法分析细胞内氨基酸含量的变化;应用免疫沉淀银染联合液相色谱—串联质谱分析(LC-MS/MS)筛选出与CD47相互作用的蛋白分子。7、应用细胞免疫荧光技术分析细胞内活性氧的水平、分析CD47与SLC3A2和脂筏的共定位情况。应用组织免疫荧光分析肝癌组织中CD47与SLC3A2或p-p38共定位情况。8、应用免疫共沉淀技术验证CD47与SLC3A2的相互作用以及对Nrf2和SLC3A2的泛素化水平进行分析。9、应用结晶紫染色分光光度仪吸光度测量(590nm)进行细胞的药物敏感性分析。10、利用二硫化钼合成生物复合材料作为分子探针检测肝癌标本中CD47分子的表达。【研究结果和结论】1、研究CD47对HCC细胞中mTORC1信号通路的影响:CD47以mTORC1依赖的方式促进HCC细胞的3D生长;CD47通过影响细胞内氨基酸含量促进mTORC1活化。2、研究CD47通过mTORC1对HCC细胞氧化还原状态的调控:CD47通过mTORC1稳定Nrf2表达进而调控HCC细胞氧化还原状态;CD47增强HCC细胞抵抗氧化应激的能力。3、研究CD47影响mTORC1的机制:CD47与SLC3A2相互作用稳定其在膜上的表达;CD47通过SLC3A2调控HCC细胞的mTORC1信号通路活性。4、靶向CD47治疗和诊断HCC的应用探索:CD47抗体通过升高ROS增加HCC细胞对奥沙利铂的敏感性;2D肽聚片层荧光材料揭示了CD47在HCC癌组织标本中呈现高表达。我们的研究揭示了CD47可促进mTORC1信号通路的激活,进而提高肝癌细胞对氧化应激的抵抗能力。在肝癌细胞中CD47可以与SLC3A2分子相互作用从而稳定其表达在细胞膜表面,并因此影响了胞内的氨基酸水平。当CD47过表达时,亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)的细胞内含量升高,从而激活mTORC1信号通路。mTORC1的活化引起p62分子的磷酸化水平升高进而使得Nrf2蛋白水平得以稳定,从而引起细胞保护性基因的表达(图15)。更为重要的是,CD47的抗体(2D3、BRIC126和CC2C6)可升高细胞内ROS水平并提高细胞的化疗敏感性。我们还合成了生物复合材料CD47分子探针,为靶向CD47分子的肝癌诊断和治疗提供数据。


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