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Notch信号通路调节的肝细胞周期参与肝部分切除术后肝再生及其机制

张粉  
【摘要】:研究背景:原发性肝癌是中国男性发病率前三位,死亡率前两位的恶性肿瘤,2015年新发病例46.61万人,占全世界发病率55%以上。随着外科手术的进步,早期手术切除是治愈恶性肿瘤的唯一手段,然而,肝脏部分切除术后肝再生障碍明显限制了手术的获益。因此明确肝脏再生机制,并寻找新的策略保护肝脏功能迫在眉睫。Notch信号通路高度保守,在机体几乎所有组织器官中广泛表达,对细胞发生、发育、分化、增殖发挥调控作用。哺乳动物Notch信号通路由4种受体和5种配体组成,配体受体结合后激活Notch信号,激活下游目的基因转录而发挥作用。近来,许多文章都报道了Notch信号通路调节肝细胞再生,然而,由于其过程和微环境的复杂性,许多基本问题仍未得到解答。近年来,缺氧导致缺氧诱导因子(Hif-1α)参与了肝脏部分切除术后肝再生,并能增加Notch信号通路的稳定性,然而,Notch信号是否对Hif-1α起调节作用,尚不清楚。肝再生依赖于肝细胞进行有丝分裂,从肝细胞数量和肝细胞体积上补充丢失的肝脏组织,当肝脏收到损伤后,处于静息期的肝细胞会重新进入到有丝分裂期,通过增加肝细胞数量来补充丢失的肝脏。肝细胞周期在肝脏再生中发挥了重要作用,最近Bibo Ke教授报道Hif-1α介导的HO-1/Cyclin D1以Akt依赖的方式在肝移植后肝脏缺血再灌注损伤中发挥重要作用。因此我们假设:Notch信号通过NICD/Akt/Hif-1α通路调节肝细胞周期参与了肝部分切除术后肝脏再生。研究目的:1.阐明Notch信号通路在PHx后肝再生中的作用;2.阐明Notch信号通路调节PHx后肝细胞周期;3.阐明Notch信号通路调节肝细胞周期的具体机制。研究方法:1.采用经典的肝2/3切除术构建大鼠肝再生模型,在术后0天、1天、3天、5天、7天获取肝脏组织,称重计算肝重体重比;2.采用HE染色观察增生的肝脏组织结构,采用免疫化学染色增殖细胞核抗原(PCNA)和增殖细胞相关的核抗原(Ki-67)在肝脏中表达情况;采用ELISA检测血清肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)水平;3.采用Western Blot和Q-PCR方法检测NICD,Hifi-1α,HES1,Notch1,Jagged1蛋白和m RNA水平;4.采用Fli-06阻断Notch信号通路后,观察肝再生情况,观察肝细胞周期和细胞周期蛋白表达水平;5.制备肝组织石蜡切片,采用Brd U染色,观察DNA复制情况,病理切片观察肝细胞有丝分裂象。6.采用经典2/3肝切除术构建肝再生模型,Akti-1/2(50 mg/kg,选择性Akt抑制剂)和PX-478(5 mg/kg,选择性Hif-1α抑制剂)术前2天开始,分别采用腹腔注射和灌胃法给药。观察抑制Akt和Hif-1α信号后肝脏再生情况;7.经典原位灌流法提取成年大鼠肝原代细胞;8.体外给予可溶性Jagged1、Fli-06、Akti-1/2和PX-478处理,Western Blot检测NICD,、Hifi-1α、p-Akt、Akt、Cyclin E1蛋白表达水平。研究结果:1.大鼠肝切除术后,肝脏迅速增生,肝重、体重比从术后第0天的1%增加到术后第7天的3.15%,基本达到正常水平。2.取肝组织制备成病理切片,HE染色发现:肝切除术后肝细胞增生活跃,肝小叶结构正常,肝细胞没有明显的水肿,小叶区无明显炎症细胞浸润;免疫组织化学染色结果提示:PCNA和Ki-67水平在肝部分切除术后明显增加,HGF和EGF水平在肝部分切除术后明显增加。4.肝部分切除术后,NICD和Hif-1α蛋白水平明显增加,Notch1和Jagged1 m RNA水平也明显增加。5.采用γ分泌酶抑制剂Fli-06特异性阻断Notch信号,NICD蛋白水平在肝部分切除术后第1天、第3天、第5天、第7天明显降低,Hif-1α蛋白水平也明显下降。6.采用FLI-06特异性阻断Notch信号,肝脏增生明显延迟,肝细胞增生减少,肝细胞周期紊乱,肝细胞周期蛋白紊乱。7.采用选择性Akt抑制剂Akti-1/2和选择性Hif-1α抑制剂PX-478处理小鼠,发现其肝脏再生明显延迟。8.给予可溶性的Notch1的配体Jagged1处理24小时,NICD、p-Akt、Hif-1α和Cyclin E1蛋白水平明显升高,给予FLI-06,能阻断可溶性的Jagged1对Notch信号及下游信号的激活作用,给予Akt的特异性抑制剂和Hif-1α的特异性抑制剂能明显下调Cyclin E1的蛋白水平。结论:1.Notch信号通路在PHx后肝再生中发挥了重要作用。2.Notch信号通路调节的肝细胞周期参与了肝脏再生。3.Notch信号通过NICD/Akt/Hif-1α通路调节肝细胞周期。


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